猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2 基因研究进展

张 航，沙惠阳，黄良宗，赵孟孟

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院，佛山 528231；河南农业大学动物医学院，郑州 450002）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respirator syndrome virus, PRRSV） 引发的一种高度接触性、烈性传染病。PRRSV感染猪体造成免疫抑制，怀孕母猪出现流产、早产、木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪呼吸系统疾病，严重危害世界养猪业。

PRRS最早于1987年在美国北卡罗来纳州被发现[1]，1991年和1992年分别在欧洲和美洲从感染猪体中分离出LV和VR-2332两种毒株[2-3]。目前按照抗原差异性将PRRSV划分为两大基因型PRRSV-1和PRRSV-2，我国主要流行PRRSV-2型毒株。1995年中国首次分离PRRSV[4]，2006年出现高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV），给仔猪致死率较高。PRRSV不断重组和变异，对我国养猪业造成巨大经济损失[5-6]。2016年我国出现新型NADC30株[7]。我国当前潜在的PRRSV流行株NADC34-like与美国PRRSV流行株1-4-4新型变异株属于同一分支[8-9]。

PRRSV基因组变异性较强，且不断重组，以NSP2最为明显[10]。2001年美国分离的MN184变异株在NSP2部分不连续缺失131个氨基酸[11]。2006年中国暴发的HP-PRRSV在NSP2部分缺失30个氨基酸[12]。我国新发NADC34-like PRRSV在NSP2部分连续缺失100个氨基酸[13]，探究PRRSV的NSP2遗传和变异特性对揭示该病具有重要意义[14-15]。

NSP2有4个差异较大结构域，分别为N端半胱氨酸蛋白酶结构域（PL2）、高变区、跨膜结构域和C端保守区。PL2具有催化活性，诱导NSP2/NSP3蛋白裂解，产生7种NSP2亚型，分别为NSP2a、NSP2b、NSP2c、NSP2d、NSP2e、NSP2f、NSP2TF[16]。NSP2对PRRSV生物学特性具有重要作用，本文对NSP2的遗传变异分析，与自身病毒蛋白互作，与宿主蛋白互作，影响PRRSV复制、毒力、细胞噬性，调节宿主免疫，在疫苗应用等方面进行综述，为PRRSV致病机理及后续疫苗研究提供理论基础。

1 NSP2 遗传变异分析

PRRSV是一种有囊膜的单股、正链RNA病毒，属于动脉炎病毒属（Arterivirus）。基因组全长约15 kb，包含10个开放阅读框（open reading frame,ORF），分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～7和ORF5a[17]。ORF1a翻译形成的pp1a多聚蛋白可被裂解成9个非结构蛋白（Non-structural protein, NSP）[18-19]，其中约2.9 kb的NSP2是最长区域。不同毒株NSP2之间存在突变、缺失或重组，核苷酸同源性较低。CH-1a株与美洲VR-2332株NSP2同源性约为80%，与欧洲LV株NSP2同源性约为40%。Zhang等[20]发现同为PRRSVⅠ型的KZ2018株和LV株同源性约88.6%。NSP2高变区可容忍核苷酸缺失、替换和插入，例如PRRSV疫苗株SP，其NSP2的C端分别插入36和155个氨基酸，其他动脉炎病毒中相应蛋白无类似特征[21]。2006年我国暴发HP-PRRSV在NSP2部分不连续缺失30个氨基酸[12]。与VR-2332相比，APRRS、PrimePac和EDRD-1在NSP2插入108个氨基酸。除氨基酸插入外，EDRD-1株的NSP2还存在117个氨基酸缺失[14-15]。与LV株相比，韩国首个Ⅰ型PRRSV KNU-07株NSP2存在60个氨基酸缺失[22]。来自中国的欧洲分离株SD01-08 NSP2部分缺失17个氨基酸（aa734～750），NSP2仍存在不同程度变异[23]。最新发现SD18株，其NSP2基因存在31个氨基酸不连续缺失，已明显区别于JXA1、HuN4、TJ等为代表30个氨基酸不连续缺失株[24]。由于NSP2基因变异性极高，使它成为监测PRRSV变异重要指标之一。

2 NSP2 与自身蛋白互作

马动脉炎病毒（Equine arteritis virus, EAV）两个跨膜非结构蛋白NSP2和NSP3相互作用，病毒感染期间诱导形成双层膜泡（double-membrane vesicles,DMVs）[25-26]。NSP5共表达形成均匀DMV，表明NSP5在调节膜曲率（membrane curvature）和DMV形成方面发挥调节作用[27]。PRRSV与EAV基因结构相似，推测PRRSV跨膜蛋白NSP2、NSP3和NSP5相互识别，并在DMV形成中发挥类似作用。通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现NSP2和NSP5都与NSP3相互作用，表明这三个PRRSV跨膜蛋白可能形成一个膜结合NSP2-NSP3(×n)-NSP5支架（membrane-bound NSP2-NSP3(×n)-NSPX5 scaffold），支持复制和转录复合物形成，促进PRRSV复制和转录[28]。Song等[29]发现PRRSV的NSP1α、NSP1β和病毒核衣壳蛋白都与NSP2直接相互作用。通过免疫荧光分析，NSP1β、NSP2、NSP4、NSP7α、NSP7β和NSP8共定位于细胞核周边，这是感染早期PRRSV RNA合成部位[30]。最近发现NSP2TF与两种主要PRRSV包膜蛋白GP5糖蛋白和膜蛋白M相互作用，驱动PRRSV组装和出芽，进一步分析表明NSP2TF靶向细胞外途径促进GP5-M二聚体形成[16]。

3 NSP2 与宿主蛋白互作

PRRSV NSP2在病毒复制中发挥重要作用，PRRSV通过与宿主细胞蛋白互作完成自身病毒复制。PRRSV仅在猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages, PAM）、非洲绿猴肾细胞（Vero）、MA-104和Marc-145细胞中增殖。Jin等[31]证明Marc-145细胞和原代PAM细胞中NSP2过表达使DEADbox RNA解旋酶18（DDX18）从细胞核转移到细胞质从而促进PRRSV复制。Wen等[32]发现细胞白介素-2增强子结合因子2（interleukin-2 enhancer binding factor 2, ILF2）可参与多种细胞通路及某些病毒生命周期，在体外与NSP2相互作用，对PRRSV复制起负调控作用。Song等[29]采用免疫共沉淀和细胞培养条件下氨基酸稳定同位素标记定量互作方法，鉴定PRRSV感染细胞过程中与NSP2互作的蛋白，发现NSP2与细胞波形蛋白（Vimentin）互作，形成可能对PRRSV附着和复制必不可少复合物，在一定程度揭示NSP2在PRRSV复制和免疫逃逸中发挥的作用。Xiao等[33]利用定量无标签蛋白质组学方法，鉴定出NSP2高变区与14-3-3蛋白互作结合。Han等[34]发现PRRSV感染过程中NSP2以不同异构体形式存在，热休克70 kDa蛋白5（heat shock protein family A (Hsp70) member 5, HSPA5）作为一种与NSP2相关细胞伴侣，对PRRSV复制具有重要意义。Zhu等[35]发现PRRSV NSP2可与骨髓细胞2（trigger receptor expressed on myeloid cells 2, TREM2）细胞质尾域互作促进PRRSV感染。

4 NSP2 对病毒复制影响

NSP2基因复制过程在双层膜泡中进行，位于细胞质靠近细胞核区域，是PRRSV复制和转录关键区域。研究表明将PRRSV NSP2转染到细胞中，建立稳定表达NSP2细胞系，接种PRRSV测定病毒含量，结果表明NSP2能促进PRRSV增殖[36]，推测NSP2的aa727～747可能和PRRSV复制能力相关[37]。Wang等[38]报道NSP2在Marc-145上可促进PRRSV复制，而NSP2受到干扰的Marc-145中PRRSV复制受到抑制。NSP2促进PRRSV复制机理中发现，NSP2 C端区域与PRRSV复制无关[39]，而NSP2中aa323～433和aa628～747区域在PRRSV复制过程中起重要作用[40]。Liu等[41]进一步通过截断蛋白瞬时表达方式发现TJM株NSP2缺失aa628～727区域能够抑制PRRSV增殖。最新发现一种适应冷环境CA-VR2332株NSP2第731位氨基酸发生突变，推测该位点在PRRSV适应低温环境中发挥重要作用[42]。

除NSP2直接影响PRRSV复制外，还存在其他途径影响病毒增殖。Wang等[43]发现NSP2通过招募BCL2相关抗凋亡基因6蛋白（BCL2-associated athanogene 6, BAG6），并利用该蛋白帮助自身定位于内质网，通过促进双层膜泡形成促进PRRSV复制。NSP2可利用N端半胱氨酸蛋白酶去泛素化酶活性，抑制凋亡诱导分子1（apoptosis inducing factor-1, AIF1）泛素化降解，促进胞内ATP合成从而影响PRRSV复制[44]。此外在PRRSV复制过程中，NSP2可作为NSP4丝氨酸蛋白酶辅助因子，参与多聚蛋白装配[45]。Gao等[46]发现NSP2/3可将激活转录因子4（activating transcription factor 4, ATF4）转移到细胞质病毒复制复合物中，以促进PRRSV RNA合成。最新研究表明NSP2磷酸化对PRRSV RNA表达有重要调节作用[47]。

综上，NSP2通过多种途径均调控PRRSV复制，NSP2高变区中一些关键区域能够影响病毒复制，其N末端区域在PRRSV复制过程中发挥重要作用。

5 NSP2 调节宿主免疫反应

Ⅰ型干扰素（Interferon, IFN）在抵抗病毒感染中发挥重要作用，同时具有免疫调节活性。NSP2在免疫调控方面主要体现在以IFN为代表的细胞因子调控方面。PRRSV编码蛋白可抑制干扰素产生，并阻碍干扰素激活抗病毒信号通路，从而造成PRRSV在猪体内持续感染[48]。NSP2分子量较高，具有高免疫原性，包括一个半胱氨酸蛋白酶结构域[49-50]，一个B细胞表位和一个NSP2潜在T细胞表位[51]。至少有18个线性B细胞表位在欧洲株和美洲株NSP2中被鉴定出来，可诱导机体产生高水平抗体，并可通过多种途径抑制IFN产生[52-54]。Brown等[53]发现NSP2能够参与病毒粒子组成，产生高水平抗体，且该抗体可保持200多天。Beura等[54]发现PRRSV 4个非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP4和NSP11能不同程度抑制IFN-β启动子活性，抑制Ⅰ型IFN介导的天然免疫反应。Li等[55]证明NSP2通过阻断IFN调节因子3（interferon regulatory factor 3, IRF3）磷酸化进而抑制IFN-β产生。Sun[56]等证明NSP2卵巢肿瘤蛋白酶（ovarian tumor-related proteases, OUT）具有泛素连接酶活性，并通过对IκB激酶复合体α（IκB kinase α, IKKα）多聚泛素化而阻止IκBα降解，而IκBα是核转录因子кB（nuclear factor-Kappa B, NF-кB）抑制因子，通过阻断核转移抑制Ⅰ型IFN产生。同时NSP2还可调节PRRSV复制，其免疫逃逸作用主要是通过阻断干扰素刺激基因15产生来抑制IFN产生。Zhu等[35]发现TREM2下调导致Toll样受体4的NF-κB通路早期激活，从而增加Ⅰ型IFN产生，进而促进细胞因子表达，激活脱丁蛋白（Disintegrin）和金属蛋白酶17（Metalloproteinase 17），促使CD163受体分裂从而抑制PRRSV感染。李洋[57]构建NSP2上3个截短突变体（PL2、中间高变区和C端跨膜区（transmembrane domain, TM））真核表达质粒，转染细胞后通过Western blot和间接免疫荧光实验检测发现，PRRSV NSP2及其TM结构域能够抑制HEK293T细胞蛋白翻译，并且NSP2对细胞翻译抑制作用依赖NSP2线粒体定位。NSP2及其TM结构域抑制细胞蛋白翻译不依赖于真核起始因子2的α亚基（eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α）磷酸化，而是阻断雷帕霉素靶标（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路抑制eIF4E 活性从而抑制细胞蛋白翻译[58]。

综上所述，PRRSV NSP2可通过多种机制抑制IFN产生调节机体免疫应答，如抑制 IFN-β启动子活性、抑制IRF3激活、阻断核转移等，NSP2在调节宿主免疫反应中扮演重要角色。

6 NSP2 与毒力影响

Li等[59]通过多个强、弱毒株基因片段置换实验证明HP-PRRSV NSP2基因不连续缺失30个氨基酸并不是其毒力增强主要原因。王兴龙等[60]选择4株PRRSV分离毒株，即YX0907、BB0907、SY0909（三种毒株均具有30 aa缺失特征）和NT0801（其NSP2上不存在缺失）进行动物实验，结果表明PRRSV毒力与NSP2 30 aa缺失没有直接联系。后续很多弱毒株（HuN4-R、JXA1-2、TJM）也存在30个氨基酸不连续缺失进一步证实这一观点。叶梦雪[61]应用四重荧光定量RT-PCR检测发现两株HPPRRSV变异株（XJl7-5株和JSTZl712-12株），其NSP2均存在30个氨基酸不连续缺失和120个氨基酸连续缺失，但动物实验结果表明XJl7-5株具有高致病力，可引起仔猪60%死亡率，而JSTZl712-12株无致病力。XJl7-5株和JSTZl712-12株有30个氨基酸不连续缺失，分别位于NSP2的 481位和533～561位，推测出缺失位点不同造成两株PRRSV毒力存在差异。

7 NSP2 在疫苗研究中应用

目前 预防PRRS主要采取疫苗免疫措施，国内灭活苗来源于CH-1a经典毒株，弱毒苗来源不同，分为经典毒株（VR-2332、CH-1R、R98）和高致病性毒株（JXA1、TJ、HuN4、GD），弱毒苗应用较广泛。现有疫苗功效欠佳，无法提供全面和普遍保护，存在毒力反强风险。商品化疫苗在病毒学和临床方面对同源毒株提供良好保护力，而对于异源毒株不同疫苗保护力差异较大。因此PRRS防控任重道远，研制基因工程疫苗和标记疫苗成为新研究方向。

NSP2缺失和插入片段具有重要诊断意义。一方面能够通过RT-PCR方法区分不同毒株[14]，另一方面已建立131个氨基酸为基础的ELISA方法可区分未缺失毒株与缺失毒株，其中该131个氨基酸包括常见的30个氨基酸缺失片段[62]。此外，TJM株由TJ株传代而来，带有120个氨基酸的连续缺失，对于鉴别野毒感染和疫苗免疫具有重要意义[62-63]。

NSP2高变区因可容忍缺失片段和稳定表达外源插入基因而在PRRSV疫苗研究中扮演重要角色。Xu等[64]从弱毒疫苗HuN4株F112 NSP2区构建一个缺失75个核苷酸感染性cDNA克隆，然后将编码新城疫病毒核蛋白NP免疫优势B细胞表位基因片段插入缺失位点。经免疫荧光实验和基因组测序发现重组PRRSV在细胞传代20次后，插入基因可得到稳定表达。用重组PRRSV免疫仔猪，然后进行攻毒，免疫仔猪对NP和PRRSV均产生特异性抗体，对NSP2未产生抗体。攻毒后实验组所有免疫仔猪均无临床症状，对照组攻毒后10 d全部死亡。该研究结果表明重组PRRSV（rHuN4-F112-Δ508-532）可作为PRRS潜在标记疫苗。Fang等[65]利用北美Ⅰ型PRRSV野毒株（SD01～08）构建全长感染性克隆，构建一种重组绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因标记PRRSV，其中NSP2免疫原性表位ES4缺失。将重组PRRSV感染猪只后用ELISA方法检测，发现与亲代PRRSV相比，重组PRRSV感染引起低水平病毒血症，这种标记PRRSV将为进一步开发标记疫苗提供理论依据。

8 NSP2 对细胞噬性影响

PRRSV仅在PAM、MA-104和Marc-145细胞中增殖，说明PRRSV具有严格细胞噬性。PRRSV通常感染体内单核-巨噬细胞系，特别是PAM以及其他组织间质巨噬细胞，如心脏、胸腺、脾脏、肝窦、肾髓质间质和肾上腺[66-68]。NSP2某些特定区域变异可以改变PRRSV感染的细胞或组织噬性。首个PRRSV缺失报道是在HB-2(sh)/2002 的NSP2中缺失aa470～481片段，只影响PRRSV在原代PAM中复制，而不影响PRRSV在Marc-145细胞中复制[69]。Song等[70]发现HP-PRRSV JXwn06株高变区缺失NSP2 aa323～521片段在PAM中丧失感染性，但在Marc-145细胞中仍能高效复制。Leng等[71]发现TJ株F19在感染3 dpi和10 dpi后，猪血清中病毒滴度显著低于TJ株F3，推测TJ株F19体内复制水平或细胞噬性发生改变，进而导致毒力降低。以上结果表明NS P2不同区域缺失导致PRRSV对细胞噬性发生明显改变。

9 总结

由于PRRSV NSP2持续变异，难以得到有效防制，严重影响世界养猪业发展。近年来NSP2在病毒遗传变异、复制、毒力，免疫调控，细胞噬性，与自身病毒蛋白和宿主蛋白互作机理方面认识 逐步加深。这些研究揭示NSP2氨基酸变异不能直接改变PRRSV毒力，但NSP2在PRRSV复制、免疫调控、细胞噬性等方面发挥重要作用。NSP2能够通过直接和间接两种途径影响PRRSV复制，其N末端区域在PRRSV复制过程中占有重要地位。NSP2在免疫调控方面主要体现在以IFN为代表的细胞因子抑制或促进方面。NSP2可通过抑制IFN-β启动子活性、抑制IRF3激活、阻断核转移等方式抑制IFN产生来调控宿主免疫。NSP2不同区域缺失导致PRRSV对细胞噬性发生明显改变。同时深入研究NSP2遗传变异有助于相关重组疫苗研究和分子标签应用，为疫苗株和野毒株鉴定提供参考。NSP2高变区可稳定表达外源基因为研制重组疫苗和标记疫苗提供可能。对NSP2功能研究有助于阐明PRRSV非结构蛋白参与免疫调控网络，因此对上述关键问题进行研究，将进一步阐明PRRSV致病机理和免疫特性提供重要理论基础，为PRRSV疫苗研究和临床防控提供新思路。