热激同源蛋白Hsc70 在病毒侵染过程中的机制研究

孙双双，李 俊，王文洁，柴文琦，周广舟

（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）

热激蛋白（heat shock proteins, HSPs）是一类高度同源的分子伴侣蛋白，可在细胞应对温度变化、紫外线辐射、药物处理和病原侵染等多种生理和压力诱导下起到保护作用。HSPs蛋白一般都含有N末端的ATP结合区（nucleotide binding domain,NBD）、底物结合区（substrate binding domain,SBD）和C末端区域。其中分子量为70 kDa左右的HSPs家族成员非常保守，几乎存在于所有生物中[1-2]。而HSP70的同源蛋白Hsc70（Heat-shock cognate protein 70），结构非常接近HSP70家族成员，同源性也较高，在细胞内多呈组成型表达模式，并在蛋白质的重折叠、转运和蛋白质泛素化降解等不同的蛋白质量控制过程中发挥重要作用。

近年来越来越多的研究表明，Hsc70还在病原感染特别是在病毒的侵染过程中参与介导吸附、内吞、侵入、脱壳、转录和翻译、病毒的组装和出芽等多个复制循环进程[3-4]，对病毒的基因组复制、病毒大分子合成和子代病毒装配等产生重要影响。深入研究Hsc70蛋白在病毒侵染过程中的作用及其分子机制将有利于厘清不同病毒与宿主互作关系，且对开发基于Hsc70靶点的抗病毒防控技术及药物等方面都具有重要意义。本文将对近年来Hsc70蛋白在病毒复制循环不同阶段发挥的作用等研究进展进行阐述，以期为未来深入探讨Hsc70在病毒侵染过程中的作用机制研究提供更多资料。

1 Hsc70 在病毒感染不同阶段的作用分析

病毒侵入宿主细胞大致分为吸附、侵入、脱壳、病毒大分子合成、装配及释放等过程。在感染起始阶段，病毒通过与细胞表面受体的结合吸附到受染细胞上，进而通过融合、胞饮和内吞等多种途径穿过胞膜进入胞浆。病毒还需要通过脱壳释放出核酸组分，进一步完成生物大分子的合成，包括病毒自身基因组复制、蛋白质合成等，为最终的子代病毒装配和释放做好准备。不同科的病毒完成这些步骤过程各异，有囊膜和无囊膜病毒之间或DNA病毒与RNA病毒之间均存在不同的路径，其间需要不同的病毒结构（非结构）蛋白、宿主细胞相关蛋白和miRNAs等的参与，展示了极大的复杂性。而近些年的研究表明，Hsc70蛋白在不同科病毒感染宿主细胞过程中，在感染的不同阶段都有可能发挥重要作用，对宿主的抗病毒免疫也有一定影响。

1.1 Hsc70参与病毒侵入过程 吸附和侵入是病毒进行感染的前端重要步骤，这其中依赖于病毒自身的衣壳蛋白和细胞表面上的一些受体蛋白等的参与。尽管Hsc70主要分布在胞质，并在胞质和胞核之间穿梭参与多种生物反应过程，但近年来的研究显示Hsc70也可以被锚定在胞膜并可以作为一些病毒侵入过程中的受体[5]。登革病毒DENV感染C6/36细胞后，Hsc70会高度表达在细胞表面并经历重定位后同病毒包膜糖蛋白E互作，参与病毒的侵入。用Hsc70抗体孵育能有效阻断DENV的吸附进而抑制病毒的感染[6]。

此外，Hsc70蛋白也参与轮状病毒的侵入过程[7-8]。研究表明轮状病毒感染上皮细胞为一个多步骤过程，需要至少唾液酸、神经节苷脂、整合素和Hsc70等的参与[9]。尽管其不同分离株通过不同的内吞途径侵入细胞，但该过程均需Hsc70的参与，如感染MA104细胞时预先用抗Hsc70抗体处理能抑制轮状病毒的感染，轮状病毒刺突蛋白VP4被切割为VP5和VP8亚片段并促进病毒的侵入过程，这其中细胞内Hsc70能结合到VP5片段上，作为病毒吸附后的细胞受体参与轮状病毒感染。但进一步地研究显示，Hsc70蛋白的ATP结合区对轮状病毒的感染却起着负调控作用，与作为细胞受体的功能一起协同影响着病毒的侵入。在ATP存在的情况下，可溶性Hsc70能降低纯化轮状病毒的侵染性60%以上，提示Hsc70的ATP酶活性会部分抑制该病毒侵染力[10]。未来更多这方面的研究可能会有助于理解Hsc70在病毒侵入过程中的作用。

1.2 Hsc70参与病毒胞内转运和解聚 病毒完成吸附之后会通过多种方式跨过细胞膜并脱壳实现基因组的内化过程。研究发现Hsc70会参与到网格蛋白介导的病毒核酸内吞过程中，其水解ATP的活性有助于网格蛋白的组装和解聚循环[11]，进而影响到多种包膜病毒的核衣壳解聚，如日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）[12]。该病毒是通过网格蛋白介导的内吞作用起始侵染的。当使用敲除Hsc70后的JEV感染C6/36细胞时，该病毒只能吸附到细胞表面而不能进一步被内吞形成酸化的内体，也不能释放病毒RNA以便在内质网膜上翻译，该过程提示Hsc70通过影响细胞内吞参与到JEV的感染[13]。

除了包膜病毒之外，Hsc70还会影响一些无包膜病毒粒子的转运。猴病毒SV40通过小窝蛋白内化并聚集在内质网，SV40病毒进一步利用内质网膜结合蛋白招募小四肽重复序列蛋白α（small glutaminerich tetratricopeptide repeat-containing protein alpha,SGTA）、Hsc70、Hsp105和Bag2等蛋白形成一个胞质复合体，介导病毒由内质网向胞质的转运[14]。其中SGTA蛋白调节Hsc70同SV40的直接相互作用，而HSP105和Bag2激发SV40和Hsc70的解聚，从而完成病毒在内质网膜的转位。除了协助SV40病毒的转运之外，对流感病毒的研究也显示，Hsc70能与病毒NS2竞争结合到M1蛋白上，参与病毒核衣壳蛋白复合体（viral ribonucleprotein, vRNP）的核输出，并在其复制过程中发挥重要作用[15]。

除了参与病毒细胞内的转运外，Hsc70还参与一些病毒的脱壳过程。如对动物呼肠孤病毒的研究显示，病毒内化入内体后会逐步解聚暴露出核心组件为后续转录做准备，这其中Hsc70会协助病毒衣壳蛋白µ1的δ片段的清除，进而释放具有转录活性的核心入胞质，特异性Hsc70抗体会阻断这一过程[16]。近年来，在一些植物病毒中也有类似的研究发现[17]。对黄瓜坏死病病毒（Cucumber necrosis virus, CNV）的研究表明，用重组Hsc70-2蛋白同CNV颗粒共孵育后会导致病毒衣壳构象变化或部分解聚，在昆诺藜植株上产生大量病灶，提示Hsc70在该病毒感染过程中发挥重要作用。

1.3 Hsc70调节病毒基因组复制 病毒需要依赖宿主细胞机器完成自身的基因组复制，目前已有研究显示Hsc70蛋白可与病毒蛋白或基因组相互作用并帮助病毒在胞内进行复制。如在MHV68鼠γ疱疹病毒感染的成纤维细胞系3T12上，鼠潜伏期相关核抗原蛋白（latency-associated nuclear antigen, LANA）能直接与Hsc70互作并招募后者到胞核，帮助形成病毒复制复合体进而促进病毒DNA复制和病毒晚期蛋白表达[18]。对人乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染HepG2.2.15细胞的研究也显示，下调细胞Hsc70蛋白表达会显著降低病毒DNA复制水平超60%[19]，因此很多研究将Hsc70作为开发潜在的抗HBV病毒药物的理论靶点[20]。此外，在鸭肝病毒（Duck hepatitis B virus, DHBV）和肠病毒EV-71等感染宿主过程中，Hsc70也被发现参与病毒复制和组装过程中[21-22]。最近，Mao等[23]对1株家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）的研究也显示，HSP/Hsc70在病毒的基因组复制、病毒扩增和出芽等多个早期侵染时段发挥关键作用，也会对病毒蛋白的丰度产生一定影响，进一步研究发现其脱乙酰化能通过蛋白酶体介导的核输入方式促进BmNPV病毒的扩增[24]。

除了同其他蛋白的互作之外，研究显示Hsc70还可以与非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）结合正向调节病毒的复制，目前已在人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）、登革病毒（Dengue virus, DENV）和西尼罗河病毒（West Nile virus, WNV）等病毒的复制过程中得到证实[25-27]。近来对狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）的研究也显示，该病毒转录的一个称为前导（leader RNA, leRNA）的小ncRNA能在病毒感染SK-N-SH细胞时干扰病毒基因组RNA和核衣壳的相互作用，达到抑制病毒复制的目的，而Hsc70通过下调leRNA来逆转这一过程[28]。此外，对埃博拉病毒（Ebola virus, EBOV）研究也表明，当病毒感染HEK293T细胞时，其基因组非编码区部分motif能同Hsc70相互作用，形成类似“锅柄”样结构并利于病毒复制[29]。

除了上述正向调节之外，Hsc70对一些病毒的复制也会有负向效应。Hsc70/HSP70能通过提供ATP装载小RNA双链体进入精氨酸蛋白的方式参与RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）组装。在DENV感染的Huh7细胞里，下调Hsc70抑制了miRNA介导的宿主RNA诱导的反应，促进了病毒基因组RNA的富集，展示了Hsc70蛋白在限制病毒复制方面的能力[30]。然而，DENV病毒编码的一个RNA诱导抑制因子蛋白NS3，能同Hsc70蛋白互作后抑制miRNAs装载到Ⅰ型精氨酸蛋白Ago1中，进而利于病毒的复制。而最近，Li等[31]对鲤春弹状病毒（spring viremia of carp virus, SVCV）的感染实验发现，其糖蛋白G会在E3泛素连接酶MARCH8介导下进行泛素化，而该过程需要Hsc70的参与，与G蛋白和MARCH8形成复合体，并最终引发G蛋白的溶酶体降解，进而导致病毒复制的下降。这其中Hsc70起到类似“脚手架”的作用，从而参与病毒的复制过程。

1.4 Hsc70参与病毒的形态发生 病毒通常招募宿主因子和自身的结构或非结构蛋白等相互作用，共同参与子代病毒粒子的装配和出芽等过程，Hsc70蛋白作为分子伴侣家族的成员经常涉及其中。如对人丙肝病毒（Hepatitis C virus, HCV）的研究显示，在感染Huh7.5细胞后，Hsc70能与HCV病毒核心和结构蛋白E2共定位在细胞脂滴周围，而该部位正是HCV组装和释放的重要位点。当用RNA干扰沉默Hsc70之后能显著降低病毒RNA的释放，但对病毒的复制水平没有影响，提示Hsc70是通过参与病毒的组装或出芽等形式调控HCV侵染性的[32]。Peng等[33]利用一个Hsc70抑制剂IMB-DM122，干扰了Hsc70的衣壳化达到降低HCV侵染性的目的。而且，Hsc70别构抑制剂能阻断HCV在胞内的装配，但对侵入、复制和翻译等过程没有影响[34]。

此外，在人HBV和乳头瘤病毒（Human papilloma virus, HPV）的研究上也取得了类似进展[35-36]。如对非包膜病毒HPV的两个衣壳蛋白L1和L2研究发现，L2可以通过招募L1蛋白到胞核并形成PML小体参与病毒组装。而Hsc70可以在胞质内同L2蛋白C末端相互作用形成复合体，然后被转位到PML小体内。若敲除Hsc70后则阻断了L2的核定位，进而影响病毒的装配，展示了Hsc70在L2蛋白整合入病毒衣壳过程中的必不可少的作用。

最近，Liang等[37]对感染水稻的呼肠孤病毒——南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）进行了研究，发现由该病毒非结构蛋白P7-1构成的含病毒小管侵染其宿主白背飞虱过程中，内质网相关降解因子DNAJB12和它的胞质伴侣分子Hsc70能被SRBSDV病毒激活并协助P7-1小管结构从内质网向胞质输出。在此过程中，病毒和Hsc70均能直接结合到DNAJB12蛋白的J结构域上。DNAJB12-Hsc70复合体被招募到P7-1小管内，敲除两者中的任一个都会显著抑制P7-1小管结构的组装，并导致病毒在宿主中的有效传播。这些结果再次展示了Hsc70在病毒装配和传染过程中的重要作用。

2 Hsc70 参与的宿主保护性免疫反应

宿主机体可通过一系列精确的免疫应答对外界入侵的病毒病原进行消灭和清除，这其中涉及细胞天然免疫和适应性免疫等抗病毒反应过程，反过来一些病毒又会进化出不同的免疫逃逸策略应对宿主的免疫应答。目前对Hsc70的研究发现其均能参与这些反应过程中，并在宿主的保护性免疫中发挥重要功能。

如目前研究比较多的病毒感染后激起的细胞凋亡和自噬等程序性反应途径，Hsc70就被鉴定为是细胞线粒体自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）过程中的决定性组分，其能特异性选择目标蛋白并转运底物给受体—溶酶体相关蛋白（lysosomal associated membrane protein type 2A,LAMP2A），启动降解过程[38]。HCV感染诱导细胞的脂滴聚集，长时间共培养游离脂肪酸和HCV能激活Huh7.5细胞的（chaperone-mediated autophagy,CMA）过程并下调Ⅰ型干扰素受体（IFN gamma to the interferon receptor, IFNAR1），破坏IFNα诱导的JAK-STAT抗病毒信号通路途径[39]。IFNAR1在溶酶体膜上通过Hsc70和LAMP2A的相互作用被选择性降解，Hsc70通过介导自噬抑制宿主的抗HCV免疫[40]。也有研究显示HCV的NS5A蛋白能同Hsc70互作并招募Hsc70至肝细胞核因子1α（hepatocyte nuclear factor 1alpha, HNF-1α），进而激起HNF-α的溶酶体降解，利于病毒的致病过程[41]。最近，对人类腺病毒的研究也显示，其E1A原癌基因能通过拮抗Hsc70和IRF3的磷酸化抑制宿主的抗病毒反应[42]。

除了上述的宿主抗病毒天然免疫之外，Hsc70还通过抗原呈递系统参与宿主的适应性免疫过程。Hsc70能呈递抗原到CD4+T细胞，具有调节T和B细胞活化及后续的浆细胞分泌抗体的潜力[43]。对人HSV-2的研究就表明，基于Hsc70的HSV-2多肽疫苗能诱导强烈的CD4+和CD8+T细胞免疫，表明Hsc70有助于CD4+T细胞识别抗原并加强宿主抗病毒免疫的能力，相关研究结果已用于临床Ⅰ期试验[44]。

3 讨论与展望

Hsc70是一个组成型表达的分子伴侣蛋白，在细胞内参与多种不同的细胞生物学过程。而在病毒感染的宿主细胞内，Hsc70能被有包膜或无包膜病毒的DNA或RNA病毒利用，并在感染的不同阶段发挥相应功能。反过来，宿主也会利用Hsc70作为一个有效的靶点通过细胞天然免疫和适应性免疫等多种途径清除外源病毒。因此，深入研究Hsc70蛋白在不同病毒感染宿主过程中的作用及分子机制，将对厘清病毒与宿主相互作用关系及开发基于Hsc70的抗病毒药物及防控技术都有重要意义。

热激蛋白及其同源家族成员多在细胞内蛋白质折叠及应对外界压力条件下起到修饰和保护作用。但有趣的是目前的大部分研究表明，在病毒感染时Hsc70蛋白多被病毒征用于不同阶段的自身复制循环，从而在病毒对宿主细胞的侵染过程中起到正向调控作用。鉴于此，科学家以Hsc70为作用靶点设计和开发了多种具有抗病毒潜力的抑制剂或小分子化合物等。HCV感染时，一些酪氨酸类似物如DCB-3503、外消旋亮氨酸等处理后，这些小分子能特异性结合到Hsc70蛋白N端的NBD结构区并刺激胞内ATP水解，最终能抑制病毒的翻译过程[45]。传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）属双股 RNA 病毒科[46]，目前广泛商品化使用的Hsc70抑制剂，VER-155008，作为一种ATP结构类似物，将其处理IBDV感染的细胞后也能较好的抑制病毒的复制[47]。近来，针对Hsc70靶点的抗猪流行性腹泻病毒（冠状病毒科成员）（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）复制的化学小分子筛选和鉴定研究也获得了一定进展[48]。当然，目前这方面的研究仍然有限，开发基于Hsc70的具有更高抑制效果、更宽抗病毒谱和具有实际临床应用价值的化合物将是今后的研究重点。

尽管目前人们对Hsc70蛋白的功能有了越来越多的认识，但毕竟早期只是把它作为胞内的分子伴侣蛋白进行研究，对其在病毒侵染过程中的功能探索并不全面。鉴于不同的病毒科成员在感染宿主过程中会有不同的路径，会涉及不同的细胞通路途径，有不同的细胞因子和病毒结构（非结构）蛋白的参与，深入阐明Hsc70蛋白在各类病毒感染进程（吸附、侵入、扩增和释放等）中的作用及分子机制将对开发针对Hsc70靶点的抗病毒策略至关重要。