基于去卵巢大鼠开展针灸治疗绝经后骨质疏松症的实验研究进展

李自如,郑 琼,迟振海,熊 鹏,毛强健

(江西中医药大学附属医院,江西 南昌 330000)

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是随着年龄的增长女性绝经后,骨吸收超过骨形成,导致骨量减少、骨脆性升高、骨组织显微结构退化,临床表现为易发生骨折的一种代谢疾病[1-2]。以往研究表明PMOP主要是由于雌激素水平的下降导致[3-4],但近年来已有越来越多的研究发现PMOP的发病涉及骨免疫异常、慢性炎性反应、骨髓微循环障碍等多方面、多通道因素调控[5]。目前,在国内外治疗PMOP方面,药物治疗仍是最常用的方法。然而,长期持续使用这些药物往往会产生一定的毒副作用[6]。针灸作为一种高效的、无毒副作用的疗法已大量应用于临床治疗PMOP,且取得较佳疗效[7-9]。一项纳入16项研究涉及1 585例PMOP患者在内的系统评价表明针灸治疗在改善PMOP骨痛、提高临床有效率等方面具有较好疗效[10],为针灸治疗PMOP提供临床证据。

为了深入了解针灸治疗PMOP机制,越来越多的学者采用动物模型进行实验研究。通过动物实验进行PMOP研究时,合理选择实验动物极其重要,去卵巢大鼠是美国食品与药品管理局和世界卫生组织推荐PMOP的模型,这种模型已被广泛应用于研究绝经后妇女发生PMOP的病理过程,并已得到公认[11]。切除双侧卵巢的大鼠体内雌激素分泌水平、骨代谢情况与绝经后妇女相似,骨转换率高,主要导致松质骨骨量减少,具有价格低廉、重复性较好的优点[12]。本文梳理了近年来基于去卵巢大鼠为模型开展的针灸治疗PMOP的实验研究,总结了学者们从多个角度探讨出的实验结论,为针灸治疗PMOP向临床应用转化提供实验证据。

1 针灸对去卵巢大鼠相关骨细胞信号转导通路的影响

1.1针灸对去卵巢大鼠Wnt/β-catenin信号通路的影响 Wnt信号转导途径是一种复杂的信号传递系统,涉及多条下游通路。其主要由外源性配体蛋白Wnt和细胞膜上的蛋白质受体结合激活,并引起一系列的细胞反应。其中Wnt/β-catenin信号通路是该系统中的核心通路,对骨代谢具有至关重要的作用。该信号通路中各种因子的水平变化会直接影响成骨细胞的生成和分化,加速骨祖细胞产生并抑制其成脂分化的过程,导致破骨细胞凋亡,从而促进骨量增加[13-14]。β-catenin是一种多功能的蛋白质,可调节细胞-细胞黏附和基因转录的协调,游离的β-catenin可从细胞膜移行细胞核,在Wnt信号传导途径中充当细胞内信号转导物,被认为是Wnt信号通路被激活的标志[15]。当细胞质中的β-catenin累积一定量时则移行细胞核,与T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)结合,促进下游靶基因的转录,进一步提高成骨细胞的数量和分化程度[16-18]。Dickkopf相关蛋白1(dickkopf-related protein 1,DKK1) 是介导骨形成的关键蛋白质之一,表现为抑制间充质干细胞和成骨细胞的正常功能,同时促进成骨细胞凋亡[19]。

实验研究显示,通过对去卵巢大鼠肾腧穴施以针刺刺激后,可明显下调细胞因子DKK1的表达水平,从而影响Wnt/β-catenin信号通路的调控机制,进而发挥调节骨代谢的作用,减缓骨质下降[20]。Wnt3a蛋白是Wnt/β-catenin信号通路的起始因子,当Wnt3a蛋白激活时,与细胞膜上的跨膜受体LRP5/6,Frizzle蛋白结合,阻止胞质内的β-catenin降解[21]。王亚军等[22]用电针去卵巢大鼠肾俞、脾俞、三阴交、足三里,电针强度为断续波,2 Hz,1.0 mA,每天1次,每次15 min,20 d为1个疗程,共治疗3个疗程,结果表明电针可显著升高去卵巢大鼠Wnt3a和β-catenin 基因及蛋白表达水平。

髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)是骨髓中含量最丰富的细胞,对骨稳态维持有重要作用[23]。BMSCs还具有分化为多种干细胞的潜能,如成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等[24]。Wnt/β-catenin信号通路作为经典Wnt转导途径,与BMSCs的增殖和成骨分化、成骨细胞和破骨细胞的增殖分化及功能密切相关[25]。姚长风等[26]研究发现,艾灸去卵巢大鼠三阴交、关元穴可上调BMSC中Wnt3a、LRP5/6、β-catenin mRNA的表达,调控Wnt/β-catenin信号转导通路,抑制Dkk1的表达,升高骨钙素水平,促使BMSCs转化为成骨细胞,恢复骨代谢平衡。

1.2针灸对去卵巢大鼠OPG/RANK/RANKL信号通路的影响 破骨细胞是PMOP发生发展的关键细胞,而OPG/RANK/RANKL信号通路在破骨细胞的产生分化过程中发挥重要作用。骨保护素(OPG)主要由成骨细胞产生,且随着细胞的分化成熟进一步增加,对破骨细胞有直接负向调控作用[27]。RANKL是TNF家族Ⅱ型同源三聚体蛋白,实验研究发现, RANKL表达增多,会增加骨组织的吸收,导致骨组织的密度降低及其他PMOP的表现[28]。RANK是一种Ⅰ型同源三聚体跨膜蛋白,是RANKL的受体激活剂[29]。OPG/RANK/RANKL信号通路对骨破坏机制的影响主要是通过RANKL与RANK结合,从而诱导破骨前体细胞接收信号分子并促进其向破骨细胞分化成熟[30]。OPG可与RANKL相结合,从而减少RANK与RANKL结合,延缓破骨细胞的分化,维持骨代谢平衡[31]。去卵巢会导致大鼠OPG水平下降, RANKL蛋白表达下降、RANK蛋白表达量升高,电针干预可上调去卵巢大鼠OPG的表达,提高去卵巢大鼠RANKL、抑制RANK的表达[32-33]。 然而,在一些学者的研究中,卵巢切除对RANKL表达的影响并不具备一致性,这种不一致性可能与样本选取、检测部位、检测方法等因素有关[34]。尹秦等[35]研究发现去卵巢大鼠下丘脑及股骨远端组织中,OPG的表达水平呈下降趋势,而RANKL的表达水平则呈上升趋势。这一结果提示下丘脑在股骨组织的RANKL/OPG信号通路表达方面发挥着协同调控的作用。针刺干预后,大鼠下丘脑及股骨组织中OPG mRNA和蛋白表达量均有显著升高,而RANKL mRNA和蛋白表达量则明显下降,说明针灸可调节OPG/RANKL信号通路表达,促进骨吸收作用,提高骨密度。

1.3针灸对去卵巢大鼠TGF-β/Smad信号通路的影响 转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) 是一种由结构相似的多功能细胞因子组成的超家族,在骨代谢过程中发挥着重要作用。TGF-β能够介导骨形成和骨吸收之间的偶联,并增强成骨细胞的数量和活性,同时刺激其增殖和分化,调控骨重建的过程,并维持骨代谢平衡[36]。研究发现PMOP患者的骨小梁内TGF-β水平下降,补充外源性TGF-β可弱化破骨细胞作用,促进骨形成[37]。TGF-β1是TGF-β超家族的多肽成员,能够调控细胞生长、增殖、分化和凋亡。Smad蛋白家族是TGF-β家族受体下游的信号转导分子,能够通过与细胞核内其他转录因子结合或直接调控DNA转录而介导TGF-β的信号转导[38]。研究结果表明,大鼠去除卵巢后股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ的表达含量发生了明显变化。然而,在进行了针刺干预后,这些指标在骨组织中趋向于好转。因此,可以推测针刺能够调节大鼠TGF-β1/Smad4信号通路的表达[39]。骨形态发生蛋白-2(BMP-2)是TGF-β超家族成员之一,可促进多种细胞的生长、分化和抑制细胞的凋亡。鲍圣涌等[40]发现电针治疗可上调去卵巢大鼠TGF-β1、BMP-2的蛋白表达水平,这一作用机制可能与同配体结合后启动Smads信号转导蛋白、激活TGF-β1/Smads、BMP-2/Smads信号转导通路、促进成骨细胞增殖分化有关。秦玮等[41]研究认为电针命门穴可调节去卵巢模型大鼠下丘脑BMP-2及Smad1/5的表达。

2 针灸对去卵巢大鼠激素的影响

2.1针灸对去卵巢大鼠性激素的影响 女性绝经后雌激素迅速下降是PMOP发生发展的主要原因。研究认为,雌激素可以通过调节胰岛素生长因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素等因子的表达,从而增强成骨细胞活性、减少成骨细胞凋亡,还可以稳定免疫系统、抑制细胞因子的炎症状态来减少对破骨细胞的刺激[42]。通过以上途径,雌激素可以达到刺激骨形成、缓解骨吸收、降低骨量流失、保持骨密度等作用。实验研究显示,去卵巢后大鼠的内分泌环境发生变化,这种变化与人类绝经期激素水平变化相吻合[43]。具体而言,去卵巢大鼠血清中卵泡刺激激素(FSH)水平呈上升趋势,而雌二醇(E2)水平则呈下降趋势,经针刺及穴位注射干预后大鼠血清FSH水平下降、E2水平升高。也有研究选取肾俞穴针刺,于去卵巢大鼠11周龄开始,每周进行3次针刺,直至26周龄,检测发现去卵巢大鼠血清E2明显升高,且提升了假手术大鼠的血浆睾酮水平[44]。胡靖等[45]采用麦粒灸干预去卵巢大鼠,发现麦粒灸治疗后去卵巢大鼠腰椎骨密度和血清E2的水平上升,血清碱性磷酸酶的水平降低。BMSCs是E2的特异性靶细胞,研究发现大鼠在去除卵巢后,其BMSCs中核受体-雌激素受体(estrogen receptor,ER)mRNA的表达下调明显,艾灸干预后ERαmRNA上调,并推测骨髓间充质干细胞中ERαmRNA表达的相对上调和血液中E2浓度增加有密切关系,可能直接对BMSCs的成骨转化产生影响[46]。

2.2针灸对去卵巢大鼠其他激素的影响 生长激素(GH)和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)是两种重要的内分泌因子,对骨代谢具有调控作用。GH能够直接刺激成骨细胞的增殖和分化,同时也可以促进破骨细胞的分化,从而对骨重吸收产生影响[47]。然而,GH的大部分作用,如促进骨骼生长等,需要IGF-1的介导。两者之间的平衡是促进骨量增加的一个重要条件。此外,在机体内,GH会被肝脏合成并释放IGF-1。这表明GH和IGF-1在骨代谢过程中紧密相关,二者的协同作用对于骨健康至关重要[48-49]。研究表明,电针联合滋肾强骨汤可改善去卵巢大鼠骨组织和血清中GH/IGF-1系统的动态平衡,增强去卵巢大鼠的骨密度[50]。瘦素(leptin,LP)是调节体重与进食的重要激素, 与瘦素受体(OB-R)结合时对骨代谢具有调节作用[51]。研究发现电针肾俞、足三里、关元、三阴交能够抑制去卵巢后大鼠血清及下丘脑中LP及、OB-R含量的升高,降低其骨形成中枢抑制作用,并认为LP在外周以促进骨代谢为主[52]。

3 针灸对去卵巢大鼠基因表观遗传修饰的影响

近年来,表观遗传学是PMOP发病机制的研究热点之一。表观遗传修饰是指在基因序列不变的情况下,通过改变DNA和组蛋白等结构上的化学修饰,对基因表达进行调控的过程。其范围涉及DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、微小RNA等多个方面。前期研究表明,表观遗传因素对骨细胞的分化和活性有很大的影响,并与PMOP的发病相关[53]。

DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式,它通过改变DNA分子的化学结构,从而对基因表达进行调控。这种修饰在生物体中广泛存在,包括在哺乳动物体内。DNA甲基化会发生在CpG二核苷酸上,同时也涉及多个甲基转移酶及相关辅助蛋白[54]。Runx2作为一种重要的转录因子,能够对骨骼发育过程中的多个关键基因进行调节。这些基因包括骨钙、骨桥蛋白、骨唾液蛋白以及Ⅰ型胶原等成骨细胞表型相关基因[55-56]。研究发现,切除卵巢后大鼠骨组织中DNA甲基化水平增高,特别是在Runx2启动子区域。这种高甲基化状态抑制了Runx2的转录和表达,从而降低了骨组织中多种成骨细胞表型相关基因,如碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等的表达水平[57]。Fan等[58]采用电针去卵巢大鼠关元穴发现电针可提高Runx2的表达水平,激活ALP,提升BGP水平,从而促进BMSCs的增殖和向成骨细胞方向分化,增加骨密度。另有研究表明,电针肾俞、足三里穴位可通过降低骨组织Runx2启动子甲基化水平,上调Runx2的表达,促进成骨细胞表型基因表达,从而增加骨密度[59]。

组蛋白是一类结构和功能多样的小分子碱性蛋白,作为DNA缠绕的线轴参与构成染色质。除了组成染色体的结构基础外,组蛋白还能通过其尾部氨基酸残基上的化学修饰来调控基因表达。组蛋白末端常见的化学修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等。组蛋白的修饰方式和程度会受到一系列结构和功能相关的蛋白质因子的调控。一些具有特定功能的蛋白质因子,如染色体去乙酰化酶和组蛋白甲基转移酶等,通过与细胞核内的特定位点相互作用,来调节组蛋白修饰的状态,以达到对基因表达的调控[60]。组蛋白去乙酰化酶2(Histone deacetylase2,HDAC2)通过调控组蛋白的乙酰化状态对骨代谢产生一定的影响[61]。 相关研究表明,电针疗法可以促进成骨细胞增殖和分化,从而有助于改善骨质疏松症。具体机制可能电针治疗抑制HDAC2的表达,使得乙酰化组蛋白H3表达水平升高,这进一步上调了Runx2基因及蛋白的表达,并促进了下游的成骨基因ALP的表达[62]。

此外,PMOP与钙调节激素(降钙素、甲状旁腺激素)、钙离子转运、免疫细胞因子有关。研究表明,电针能增强参与钙离子吸收跨细胞途径的TRPV5,PMCAlb的mRNA和蛋白表达以及细胞旁途径ZO-1,occludin的mRNA和蛋白表达,提高去卵巢大鼠的骨密度[63]。

4 小 结

以往的研究中,针灸治疗PMOP主要集中在激素和骨形态学方面。然而,近年来学者们开始从不同的角度出发,包括信号通路、细胞因子以及基因表观遗传等多个领域,探讨该病的发病机制。这种多角度的探索方式有利于更深入地了解该疾病,从而为针灸治疗的实验研究提供更加丰富的证据支持。

尽管研究已经在不断进展,但是目前仍存在一些问题。例如:在激素方面,研究主要集中在性激素上,缺乏对于钙调节激素的研究,而钙调节激素是PMOP发病的关键。因此,为了更好地理解该疾病,未来需要加强相关研究,包括钙激素相关受体、调节基因、调节信号通路等。

当前,针灸干预手段主要采用毫针针刺和电针,但是关于刺激参数的研究较少。完善刺激强度、时间、频率等方面的研究,有助于我们更好地理解针灸对于PMOP的影响。此外,尽管少量实验采用艾灸干预,但是针灸治疗手段非常丰富,未来可以选用如热敏灸、穴位贴敷等多种干预手段进行研究。

在选穴方面,中医理论认为PMOP属于“骨痿”范畴,而肾主骨和脾肾虚是其发生的根本机制[64]。因此,基于这一原则,可以选择补益脾肾穴位如肾俞、脾肾、太溪、命门以及三阴交等进行研究,并验证穴位特异性,或者通过多穴配伍方式观察联合效果,最终促进实验研究向临床转化。

综上所述,去卵巢大鼠的病程演变和病理变化与PMOP患者十分相似。基于去卵巢大鼠开展的针灸治疗PMOP的研究结果显示,针灸可以多靶点、多途径干预PMOP。然而,目前仍存在一些问题,例如今后的相关实验应该基于临床进行,丰富干预手段,针对选穴、刺激参数、干预时长等方面开展标准化的针灸干预PMOP研究,以确定高效的规范化治疗方案;PMOP有明显的时间性,与绝经关系密切,因此可利用针灸具有预处理的机制特点,将针灸治未病应用到PMOP的研究中,探索针灸提早介入PMOP的疗效;针灸发挥作用具有多层面、多靶点、多通路的特性,还应加强相关信号通道、受体途径以及基因修饰等机制的研究。总之,针灸治疗PMOP的实验研究面临着多个挑战和机遇,需要我们以更加全面、深入的方式来理解该疾病及其治疗方法。未来的研究方向应包括但不限于从激素到其他关键因素的研究,优化干预手段并系统评估效果,探索治未病的新思路,并加强对于针灸在分子机制层面上的解释与研究。通过深入研究,我们相信将会有更多的突破和进展,为针灸干预PMOP提供更加有效和可靠的证据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。