线粒体解偶联蛋白2 基因多态性及启动子区域基因型与糖尿病肾病发病的关系

何爱琴，石彩凤，周阳，杨俊伟，吴小梅

南京医科大学第二附属医院肾脏病中心，南京 210003

糖尿病是全球性的公共卫生问题，其中90%是2型糖尿病［1］，糖尿病肾病（DKD）是其主要的微血管并发症之一，已经成为慢性肾脏病的主要病因，显著增加心血管死亡的风险［2］，早期识别DKD 发病的高危人群以及对危险因素进行早期干预是亟待解决的难题［3］。研究［4］显示，DKD 受到基因及环境多种因素的影响。解偶联蛋白2（UCP2）分布在线粒体内膜上，在人体中广泛表达，包括白色脂肪组织、胰岛、视网膜细胞和肾脏。UCP2 能通过“质子漏”作用使线粒体内膜外的质子直接进入线粒体基质，降低内膜两侧的质子电化学梯度，使氧化过程与二磷酸腺苷磷酸化解偶联，使得三连酸腺苷合成减少，以及降低活性氧的产生。UCP2 的这种解偶联作用涉及多种组织功能，如产热、葡萄糖分泌、游离脂肪酸代谢以及调节自噬等［5］，敲除小鼠UCP2基因可以缓解急性肾损伤［6-7］。UCP2 被认为是代谢综合征、胰岛素抵抗、2型糖尿病和肥胖的候选基因［8-9］，其启动子区域基因多态性会影响UCP2 的表达、胰岛素释放和敏感性。UCP2 基因存在3 个常见位点的多态性，包括启动子区域的-866G/A 位点的基因多态性（rs659366），外显子4中的Ala55Val位点的基因多态性（rs660339），以及3'未翻译区域（3'UTR）中的45 bp 插入/删除（Ins/Del）位点的基因多态性［10-13］。尤其是-866G/A 位点与UCP2 的表达密切相关，与G等位基因相比，A等位基因与UCP2 mRNA 表达增高相关［12，14］。但目前中国人群中UCP2 基因多态性与DKD 发病的关系尚不明确。本研究观察了UCP2基因多态性，并分析UCP2 基因启动子区域基因型与DKD发病的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取南京医科大学第二附属医院收治的2型糖尿病患者180例。纳入标准：①年龄18～75岁；②诊断为T2DM，符合美国糖尿病学会2020年制定的糖尿病诊断标准。排除标准：①曾接受肾脏替代治疗，如肾移植、透析等；②任何感染性疾病的急性期；③肝硬化失代偿期；④自主能力受损；⑤肾活检组织病理提示存在非糖尿病肾病；⑥急性肾损伤。180例患者根据尿白蛋白/肌酐比值（ACR）和预估肾小球滤过率（eGFR）分为DKD 患者92 例［糖尿病肾病组，ACR≥30 mg/g、eGFR＜60 mL/（min·1.73 m2）］和单纯糖尿病患者88 例［单纯组，ACR＜30 mg/g、eGFR≥60 mL/（min·1.73 m2）］。糖尿病肾病组男性54 例、女性38例，年龄62.00（52.25，66.00）岁，BMI 24.99（23.25，28.17）kg/m2，血白蛋白43.70（38.28，47.83）g/L，糖化血红蛋白 8.35%（6.98%，10.30%）；单纯组男性49 例、女性39 例，年龄60.00（57.00，66.00）岁，BMI 24.80（22.99，26.67）kg/m2，血白蛋白42.20（37.80，45.40）g/L，糖化血红蛋白8.60%（7.23%，9.88%）。本研究经南京医科大学第二附属医院伦理委员会审核通过（批准号：2019KY097），所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 UCP2基因测序 设计并合成好SNP位点的引物池，然后通过两步PCR 的方法完成目标SNP 位点序列的扩增和兼容Illumina 测序文库的制备。第一轮PCR 体系如下：DNA 模板（10 ng/μL）2 μL，上游引物池（10 μmol/L）1 μL，下游引物池（10 μmol/L）1 μL，2×PCR Ready Mix 15 μL（总体积25 μL）（Kapa HiFi Ready Mix）。配制好反应体系后，在PCR 仪（BIO-RAD，T100TM）上执行以下反应程序：98 ℃预变性3 min，然后执行8个循环，条件是98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。紧接着执行25 个循环，条件是98 ℃变性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。最后72 ℃延伸5 min。反应完成后，使用AMPure XP 磁珠纯化回收PCR 产物。然后以第一轮PCR 产物为模板执行第二轮PCR 反应，以获得测序带分子标签的文库。反应体系如下：DNA模板（10 ng/ μL）2 μL，通用P7 引物（含分子标签，10 μmol/L）1 μL；通用P5 引物（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL（总体积 30 μL）。配制好反应体系后，执行如下PCR 程序：98 ℃预变性5 min，然后执行5 个循环程序，94 ℃变性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，最终72 ℃延伸5 min，完成后一直4 ℃。最终PCR 产物使用AMPure XP 磁珠纯化回收。各个PCR 产物等量混合后，使用HiSeq XTen 测序仪（Illumina， San Diego， CA）进行测序。引物序列如下：rs660339：5'-CAGTGTTTGGAGCATCGAGATGACT-3'，5'-GTTTGACAGAATCATACAGGCCGAT-3'；rs659366：5'-TCCCTTCTGCTGGTGAAAACACATA-3'，5'-GGGATGAGAAAAGGCGTCAGGAGAT-3'；3'UTR：5'-TTCCTGGAACGTGGTGATGTTCGTC-3'，5'-ACCAGCACTGAGACAATGAGTAGAT-3'。

1.3 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计数资料以频率或百分比表示，组间比较用χ2检验检验。利用二元Logistic回归分析研究UCP2基因启动子区域位点-866G/A 基因型与DKD 发病的关系，应用显性和隐性模型来解释基因型与表型之间的关系，显性突变模型认为，只要个体的基因型中至少一个等位基因是突变的，相关表型就会表现出来，而隐性模型则更为严格，认为只有当个体的基因型中两个等位基因都是突变的时候，相关表型才会显现。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组UCP2 基因型频率比较 糖尿病肾病组-866G/A 位点G/G 基因型频率为33.0%、G/A 基因型频率为40.9%、A/A 基因型频率为26.1%，单纯组分别为30.4%、56.5%、13.0%，两组A/A 基因型频率比较，P＜0.05；糖尿病肾病组Ala55Val位点C/C基因型频率为31.8%、C/T基因型频率为42.0%、T/T基因型频率为26.1%，单纯组分别为28.3%、57.6%、14.1%，两组比较，P＞0.05。45bp INS/DEL位点DEL/DEL 基因型频率为73.9%、DEL/INS 基因型频率为23.9%、INS/INS基因型频率为2.3%，单纯组分别为84.8%、13.0%、2.2%，两组比较，P＞0.05。

2.2 UCP2 基因启动子区域位点-866G/A 基因型与DKD 发生的关系 在-866G/A 隐性模型中，A/A 基因型是DKD 发生的风险因素，相比于G/A 和G/G，A/A 基因型发生DKD 的风险增高2.359 倍［2.359（1.091～5.099），P=0.029］；当矫正性别、年龄后，A/A 基因型发生DKD 的风险增高2.491 倍［2.491（1.142～5.437），P=0.022］；当进一步矫正性别、年龄、糖尿病病程、糖化血红蛋白、尿酸、总胆固醇后，A/A 基因型发生DKD 的风险增高2.491 倍［2.489（1.004～6.172），P=0.049］。在-866G/A 显性模型中，相比于G/G 基因型，G/A 和A/A 基因型发生DKD的风险无统计学差异。

3 讨论

糖尿病人群中约40%的患者合并DKD，DKD 已经成为慢性肾脏病乃至终末期肾脏病的主要病因，并且更为严重的是，DKD 显著增加心血管死亡风险，预计到2040 年DKD 将成为全球第5 大常见死因［15］。由于存在尿蛋白波动甚至恢复正常、GFR 快速下降及无蛋白尿型DKD 等临床表型，依据尿蛋白和eGFR诊断DKD的可靠性已备受争议［16］。近年来，人们已经发现一些DKD 诊断的生物标志物，比如TNF受体、小管损伤标志物等，但是由于缺乏大规模临床验证，其应用仍受到制约。目前，DKD的治疗主要包括控制血压、血糖等，特异性针对DKD的治疗有限，且只能延缓而不能逆转肾功能进展。早期识别DKD 的高风险人群是改善DKD 预后的重要步骤。DKD 的发病机制复杂，多种因素与DKD 的发生和进展相关。研究［17］发现，不论是T1D 还是T2DM，DKD的发生均具有家族聚集性。其中遗传因素与DKD的发生关系密切，因此，研究特定蛋白的基因多态性是识别DKD发病高风险人群的重要手段。

UCP2是重要的能量代谢的相关蛋白，其可以减少活性氧的产生，被认为是参与代谢疾病重要的分子。我们实验室前期研究［18］发现，口服UCP2 抑制剂京尼平可减少葡萄糖诱导的白蛋白通过足细胞单层的渗漏，从而阻止C57BL/6J 小鼠DKD 的进展，认为UCP2 是参与DKD 发生及进展的重要蛋白。UCP2基因于1997年被首次发现［19］，其位于大鼠1号染色体、小鼠7号染色体和人类11号染色体上［20］，人类UCP2 基因包括8 个外显子和7 个内含子。UCP2启动子区域的基因多态性可以改变UCP2 的蛋白表达。截至目前为止，UCP2基因中大多数已确定的多态性都显示出低频率，因此尚未得到深入的研究。本研究发现，UCP2 启动子区域3 个常见基因多态性位点中只有-866G/A 位点与DKD 的发生有关，在调整混杂因素后，-866G/A 位点A/A 基因型发生DKD的风险增高2.489 倍。既往研究［21］已经发现，-866G/A 多态性具有明确的功能，通过改变转录因子的结合位点影响基因的表达，与氧化应激标志物水平升高有关。我们猜想，可能是由于-866G/A 基因位点参与调节UCP2 的蛋白表达，因此其与DKD发病的关系更为密切，遗憾的是本研究中仅仅关注了UCP2 基因多态性与DKD 发生的关系，后续需要进一步的研究阐明UCP2 基因多态性与肾脏UCP2表达的关系。尽管目前没有证据表明Ins/Del 多态性对UCP2 表达具有功能性影响，但它位于基因的3'非翻译区，该区域是microRNA 连接的主要位点，而microRNA 是基因表达的主要调节因子，Ins/Del多态性可能会改变某些microRNA 的连接位点从而影响基因表达［22］。而Ala55Val 多态性导致保守氨基酸变化，但没有迹象表明它会导致蛋白质功能变化。本研究并未发现UCP2 启动子区域的另外两个位点的基因多态性与DKD 的相关关系，这与之前的研究结果也是一致的，可能是位点的突变并未影响UCP2的蛋白表达或者功能。

总之，UCP2 基因-866 G/A 基因位点多态性与DKD 的发病显著相关，携带A/A 基因型的的糖尿病患者发生DKD 的风险显著增加，这一发现为针对糖尿病患者的早期干预提供了重要依据。需要进一步研究阐明UCP2 基因多态性与肾脏UCP2 表达的关系，推动DKD诊治的精准化和个体化管理。