基于转录组的茎用莴苣抽薹相关差异表达基因分析

武 一 孙雪梅 杨世鹏 谭龙 王丽慧

摘要：為探究影响茎用莴苣抽薹的相关关键基因，采用高通量转录组测序的方法，研究茎用莴苣产品器官收获期和抽薹期的差异表达基因。结果表明，茎用莴苣种质资源1号在产品器官收获期和抽薹期的差异表达基因数量为6 754个，茎用莴苣种质资源3号在产品器官收获期和抽薹期的差异表达基因数量为5 444个。基因本体（GO）功能富集分析结果表明，差异表达基因主要富集在结合、催化活性、细胞过程、代谢过程、细胞解剖实体等GO条目中。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析结果表明，茎用莴苣种质资源1号和茎用莴苣种质资源3号分别有133条和129条KEGG代谢通路，其中有128条代谢通路在2份种质资源中均被注释；差异表达基因富集较多的KEGG代谢通路有次生代谢物的生物合成、植物激素信号转导、植物-病原体的相互作用等。转录因子分析结果表明，茎用莴苣产品器官收获期和抽薹期的差异表达基因大多数属于AP2/ERF、bHLH、bZIP、C2H2、MYB、NAC、WRKY等转录因子家族。对茎用莴苣产品器官收获期和抽薹期差异表达基因的研究结果进行综合分析，发现在AP2/ERF、WRKY、bHLH等转录因子家族以及次生代谢物的生物合成、植物激素信号转导等通路中存在较多的差异表达基因，推测这些转录因子家族和代谢通路可能参与茎用莴苣抽薹的调控网络。本研究结果为解析茎用莴苣抽薹相关基因及其分子机制奠定了基础。

关键词：茎用莴苣；抽薹；转录组；差异表达基因

中图分类号：S636.2文献标识码：A文章编号：1000-4440（2024）04-0711-10

Analysis of differentially expressed genes related to bolting in stem lettuce based on transcriptome data

WU Yi，SUN Xue-mei，YANG Shi-peng，TAN Long，WANG Li-hui

（Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Qinghai University， Qinghai Key Laboratory of Vegetable Genetics and Physiology， Xining 810016， China）

Abstract：To explore the key genes influencing bolting in stem lettuce， high-throughput transcriptome sequencing was employed to study the differentially expressed genes during the organ harvesting and bolting periods of stem lettuce. The results revealed that there were 6 754 differentially expressed genes in stem lettuce germplasm resource No.1 during the organ harvesting period and bolting period， while stem lettuce germplasm resource No.3 had 5 444 differentially expressed genes during these periods. Gene ontology （GO） functional enrichment analysis indicated that differentially expressed genes were mainly enriched in GO entries such as binding， catalytic activity， cellular processes， metabolic processes， and cellular anatomical entities. Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis showed that stem lettuce germplasm resource No.1 and stem lettuce germplasm resource No.3 had 133 and 129 KEGG metabolic pathways respectively， with 128 metabolic pathways annotated in both germplasm resources. KEGG metabolic pathways with a relatively higher enrichment of differentially expressed genes included biosynthesis of secondary metabolites， plant hormone signal transduction， and plant-pathogen interactions. Transcription factor analysis revealed that most of the differentially expressed genes during the organ harvesting and bolting periods of stem lettuce belonged to transcription factor families such as AP2/ERF， bHLH， bZIP， C2H2， MYB， NAC and WRKY. Comprehensive analysis results indicated that there were numerous differentially expressed genes in transcription factor families such as AP2/ERF， WRKY， bHLH， as well as pathways involving biosynthesis of secondary metabolites and plant hormone signal transduction. It was speculated that these transcription factor families and metabolic pathways could participate in the regulatory network of bolting in stem lettuce. These results can provide scientific basis for understanding the genes related to bolting in stem lettuce and their molecular mechanisms.

Key words：stem lettuce;bolting;transcriptome;differentially expressed genes

茎用莴苣（Lactuca sativa L.）属于菊科莴苣属，又称莴笋、莴菜等，是一年或二年生草本植物[1]，在中国许多地区均有种植。茎用莴苣中含有丰富的矿物质，其中的铁元素（茎用莴苣肉质茎中铁元素的含量为20.00 mg/kg；白菜中铁元素的含量为5.39 mg/kg；萝卜中铁元素的含量为5.00 mg/kg）可以被人体吸收利用，防治缺铁性贫血；钾元素（茎用莴苣肉质茎中钾元素的含量为3 186.00 mg/kg；白菜中钾元素的含量为1 593.00 mg/kg；萝卜中钾元素的含量为1 730.00 mg/kg）可用于降血压和预防心律紊乱；胡萝卜素（茎用莴苣肉质茎中胡萝卜素的含量为0.30 mg/kg；白菜中胡萝卜素的含量为0.60 mg/kg；萝卜中胡萝卜素的含量为0.20 g/kg）可用于防癌和抗衰老[2-5]。Hou等[6]对莴苣的化学成分进行研究，发现其主要包含三萜、黄酮和倍半萜内酯等。戴国辉等[7]研究发现，茎用莴苣的肉质茎和叶片中均含有山莴苣苦素、莴苣黄质等多种化合物。

茎用莴苣作为一种营养丰富、口感较好的蔬菜，深受各类人群的喜爱，市场需求量也越来越大。然而，由于受到外界生长环境和品种自身特点的影响，茎用莴苣在种植过程中容易出现早抽薹现象，导致储存在肉质茎中的养分迅速转移到花薹中[8]，使肉质茎无法正常生长发育，从而影响产量和质量，降低经济效益[9]。茎用莴苣的食用部位主要是肉质茎，预防茎用莴苣早抽薹可以确保其产量和质量。

目前，与植物抽薹开花有关的研究大都集中在十字花科作物（如萝卜[10]、白菜[11]、拟南芥[12]、甘蓝型油菜[13]）上，对莴苣[14]抽薹开花的研究较少。LsFT是最早从叶用莴苣中鉴定出来的与开花相关的基因，在叶用莴苣中过表达LsFT基因则使莴苣开花时间提前，沉默LsFT基因则使莴苣开花时间延迟[15]。Ning等[16]对莴苣不同的花发育阶段进行研究，发现了1个参与开花的基因LsMADS55。Han等[17]对不同温度下生长的叶用莴苣进行转录组测序分析，挖掘出与抽薹有关的基因LsSOC1和LsFT，敲除这2个基因均会延迟抽薹。Chen等[15]研究发现，赤霉素参与叶用莴苣抽薹的调控，在热诱导叶用莴苣抽薹期间，叶片中的赤霉3（GA3）、赤霉素4（GA4）水平以及茎中的生长素水平均显著提高[18]。DELLA蛋白负调节赤霉素信号通路，Wang等[19]在莴苣中鉴定了4个DELLA蛋白编码基因，包括LsRGL1，在莴苣中敲除该基因可促进抽薹，而该基因过表达可抑制抽薹以及赤霉素和生长素的生物合成。在某些植物中，生长素也可以诱导开花，生长素响应基因受生长素受体基因（TIR1）、生长素响应因子（ARF）家族以及AUX/IAA转录因子家族的影响[20]。有研究发现，蛋白质丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STPK）以及热激蛋白基因Hsp70-2711和Hsp70-3711可能参与叶用莴苣的抽薹[21-23]。本研究拟以茎用莴苣种质资源1号、3号为试验材料，于产品器官收获期和抽薹期分别进行取样，利用Illumina Hiseq进行转录组测序分析，探究影响茎用莴苣抽薹的关键基因，以期为培育耐抽薹的茎用莴苣品种奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

供试样品为青海大学农林科学院园艺研究所收集的茎用莴苣种质资源1號（绿色茎用莴苣）和3号（紫色茎用莴苣）（表1），种植于青海大学园艺创新基地，常规栽培管理，在不同生育期（产品器官收获期、抽薹期）选取长势一致的植株，取叶片和肉质茎混匀，各3个生物学重复，样品保存于-80 ℃冰箱中，用于总RNA提取。

1.2试验方法

1.2.1总RNA文库的构建和测序使用TRIzol法[24]提取RNA，再参考胡小蓉等[24]的检测方法对样品RNA的质量进行检测，保证后续使用的RNA可以满足文库构建和测序的需要。RNA质量达标后，mRNA先使用胸腺嘧啶组成的核苷酸链［Oligo（dT）］磁珠富集，再随机打断。以随机打断的mRNA和随机寡核苷酸为材料，组成第1条、第2条cDNA，获得cDNA文库。文库构建完成后，先使用Qubit2.0荧光定量仪进行初步定量，再使用Agilent 2100生物分析仪对文库的插入片段大小进行检测，插入片段大小符合预期后，使用Illumina HiSeq平台进行测序。转录文库构建和测序工作委托武汉迈特维尔生物科技有限公司完成。

1.2.2测序数据分析对Illumina HiSeq平台测序获得的原始数据进行质量分析并去除低质量序列和接头序列后，得到高质量序列。使用HISAT软件[25]将过滤后的高质量序列与参考基因组和基因注释文件（基因登录号：GCF_002870075.3）比对，进行基因注释。

1.2.3差异表达基因分析使用DESeq2软件[26]进行差异表达分析，得到Z1和Z3的比较组、Z2和Z4的比较组这2个比较组之间的差异表达基因，筛选标准：|log2Fold Change|≥1，且校正后的P值（FDR）＜0.05，Fold Change为2个组之间基因表达水平的比值。对于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库，以通路为单位进行超几何分布检验；对于基因本体（GO），则基于GO条目进行分析，并利用iTAK软件[27]进行转录因子分析。

2结果与分析

2.1RNA-Seq测序数据统计分析

本研究共完成12份样品的测序分析，结果（表2）表明，高质量reads的碱基总数为83.22 Gb，每份样品高质量reads的碱基总数均超过6.00 Gb。Q20（碱基质量值不低于20的碱基数占总碱基数的比例）和Q30（碱基质量值不低于30的碱基数占总碱基数的比例）均在90.00%以上，G+C含量为44.31%～45.55%，能够比对到参考基因组的reads所占比例为88.46%～94.33%；茎用莴苣种质资源1号在产品器官收获期和抽薹期具有唯一匹配的reads所占比例均值分别为89.42%和87.85%；茎用莴苣种质资源3号产品器官收获期和抽薹期具有唯一匹配的reads比例分别为90.77%和83.99%。主成分分析结果（图1）表明，每组的样品都聚集在一起，表明重复样品间具有较高的相似度及重复性[28]。上述研究结果表明测序数据质量合格、可靠性较高，可开展下一步研究。

2.2差异表达基因

筛选差异表达基因的标准为|log2Fold Change|≥1，且FDR＜0.05。Z1和Z3的比较组中差异表达基因为6 754个，上调表达基因有3 273个，占48.46%，下调表达基因3 481个，占51.54%；Z2和Z4的比较组中差异表达基因为5 444个，上调表达基因有2 879个，占52.88%，下调表达基因2 565个，占47.12%（表3）。

对筛选出的与抽薹相关的差异表达基因进行层次聚类分析，图2显示，每组的3个生物学重复均聚成一簇，表明样品的生物学重复性良好，数据的可靠性高，聚类分析将与抽薹相关的差异表达基因大致分为5类。差异表达基因韦恩图（图3）显示，有2 579个差异表达基因在Z1和Z3的比较组、Z2和Z4的比较组中共同表达，其中上调表达的基因有1 217个，下调表达的基因有1 267个。

2.3GO功能富集分析

GO功能富集分析分为分子功能（Molecular function，MF）、生物学过程（Biological process，BP）和细胞组分（Cellular component，CC）3个类别[29]。Z1和Z3的比较组、Z2和Z4的比较组中差异表达基因富集的GO条目分别有44个和46个，其中共同富集的GO条目有44个，本研究只列出差异表达基因显著富集的32个条目（图4）。BP差异表达基因富集较多的GO条目为细胞过程和代谢过程；MF差异表达基因富集较多的GO条目为结合和催化活性；CC差异表达基因富集较多的GO条目为细胞解剖实体和含蛋白质复合体。在细胞过程和代谢过程差异表达基因富集较多，这一结果与其他植物的转录组测序结果[30]一致，表明茎用莴苣在抽薹过程中细胞活动和代谢均较活跃。

2.4KEGG通路富集分析

在KEGG数据库中，Z1和Z3的比较组、Z2和Z4的比较组中的差异表达基因分别被注释到133条、129条KEGG通路，2个组共同注释到的KEGG通路为128条。利用KEGG数据库富集出茎用莴苣抽薹过程中差异表达基因表现出显著性差异的前20条通路。前20条通路差异表达基因数量见表4和表5，茎用莴苣抽薹过程中差异表达基因富集的通路主要有次生代谢物的生物合成（ko01110）、植物激素信号转导（ko04075）、植物-病原体的相互作用（ko04626）等。通过对KEGG富集通路的研究结果进行分析发现，代谢途径的差异表达基因只在Z2和Z4的比较组中显著富集，在Z1和Z3的比较组中没有显著富集，其原因可能是紫色茎用莴苣较绿色茎用莴苣早熟，一些物质的调控作用需要被提前激活，提前启动代谢途径，但具体原因还需进一步探究。

2.5转录因子分析

转录因子在植物生长和发育中起着调节作用[31]。图5显示，Z1和Z3的比较组、Z2和Z4的比较组分别鉴定到74个和68个转录因子家族，分别包括501个和458个差异表达基因。Z1和Z3的比较组、Z2和Z4的比较组中的差异表达基因大多数都属于AP2/ERF（56个、43个）、bHLH（38个、34个）、MYB（37个、30个）、NAC（27个、19个）、WRKY（24个、21个）、C2H2（23个、13个）、bZIP（19个、14个）等转录因子家族，表明这些转录因子家族可能在茎用莴苣抽薹过程中起着一定作用；在TUB、NF-YB、HB-other、DBB、FAR1等转录因子家族中的差异表达基因数量最少，只有1个。

3讨论

高通量转录组测序技术可以用于研究差异表达基因及其调控机理[32]。差异表达基因是发生应激效应时表达水平发生显著性变化的基因，研究差异表达基因可以明晰基因的功能，也可以为研究相关分子机制提供丰富的参考数据[33]。茎用莴苣是一种具有较高营养价值的蔬菜，但其提早抽薹会影响食用口感及商品价值，目前，对茎用莴苣的研究主要集中于栽培技术[34]及产量[35]等方面，茎用莴苣抽薹的机理尚不清楚，有待进一步研究。

抽薹会长出花薹，使植株高度增加[36]，植株在花芽分化期间，如果遇到长日照高温条件，体内生长素含量升高，就会出现抽薹现象，发生抽薹初期茎顶的亚顶端细胞伸长[37]。GO功能富集分析结果表明，Z1和Z3的比较组、Z2和Z4的比较组中差异表达基因富集较多的GO条目包括细胞过程，表明抽薹过程中有一系列细胞的变化。本研究中，Z1和Z3的比较组、Z2和Z4的比较组中的差异表达基因在次生代谢物的生物合成通路和植物激素信号转导通路中富集较多，且这2条通路中的差异表达基因数量均表现为上调表达基因数量大于下调表达基因数量，推测在茎用莴苣抽薹过程中这2条通路发挥着重要作用。

WRKY家族转录因子可以影响植物的次生代谢[38-43]，对次生代谢物的积累起调控作用[44]，并且已有研究结果证明WRKY家族转录因子可以参与其他激素介导的信号转导，从而对植物体细胞的发育起到间接调控作用[45]。对转录组数据进行分析发现，茎用莴苣种质资源1号和3号均有较多的差异表达基因属于WRKY家族。Ishida等[46]的研究结果表明，WRKY家族转录因子对植物的开花时间具有一定的调控作用，拟南芥在长日照条件下过量表达WRKY25，会导致其开花时间提前[47]。苏蔚等[48]发现，转录因子BcWRKY22可以调控菜心提前开花，在拟南芥中异源表达棉花GbWRKY1基因，发现植株抽薹开花时间明显提前，且GbWRKY1对植物开花时间的调节主要通过赤霉素途径实现[49]，由此推测WRKY家族转录因子可能会通过影响一些次生代谢物的积累和植物信号转导途径进而影响茎用莴苣的抽薹过程。

有研究结果表明，bHLH家族转录因子参与植物信号转导、次生代谢等多种生物学过程[50]，当bHLH家族转录因子TT8和WD40的功能被抑制時，甘蓝的开花时间会提前[51]。拟南芥的AtbHLH113基因和SPL9基因在蛋白质水平上相互作用，进而影响开花时间[52]。bHLH转录因子家族富集的差异表达基因数量较多，因此其可能参与茎用莴苣抽薹的调控。谢德金等[53]研究发现MYB家族转录因子可以调节植物次生代谢物的生物合成。茎用莴苣抽薹后次生代谢物的生物合成通路中差异表达基因上调表达数量大于下调表达数量，且此通路中差异表达基因数量较多，可能与MYB转录因子对次生代谢的调控有关，目前关于MYB转录因子对抽薹影响的研究较少，不能推测其是否参与茎用莴苣的抽薹过程。

AP2/ERF轉录因子家族的AP2亚家族基因会影响植物花的发育，在拟南芥中，AP2同源基因对花的生长有影响，包括花分生组织的形成和花器官的生长发育，对参与花发育相关基因的表达具有调控作用[54]。然而，拟南芥的AP2基因也参与抑制成花关键基因SOC1和AG的表达，并与miR172基因结合，对开花时间进行负调节[55]。有研究发现次生代谢物的生物合成通路中差异表达基因富集较多，而AP2/ERF转录因子家族在植物次生代谢调控中发挥着重要作用[56]。Feng等[57]利用高通量测序技术分析鸭茅在不同生育期的转录组变化，发现ERF2基因在抽薹前期显著表达。本研究中差异表达基因属于AP2/ERF转录因子家族的数量最多，推测AP2/ERF转录因子家族可能会通过影响植物的次生代谢进而调控茎用莴苣的抽薹。

4结论

本研究对茎用莴苣产品器官收获期和抽薹期的叶片和肉质茎进行转录组测序分析，结果表明，在产品器官收获期和抽薹期差异表达的基因大多数属于AP2/ERF、WRKY、bHLH等转录因子家族，次生代谢物的生物合成、植物激素信号转导等KEGG通路富集的差异表达基因较多。因此，今后可在这些转录因子家族和代谢通路中开展挖掘茎用莴苣抽薹相关基因的研究。

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（责任编辑：王妮）

收稿日期：2023-03-21

基金项目：青海省科学技术厅基础研究项目（2022-ZJ-745）；国家重点研发项目（2022YFD1602400）

作者简介：武一（1998-），女，河南驻马店人，硕士研究生，主要从事蔬菜遗传育种研究。（E-mail）wuyi77abc@163.com

通讯作者：王丽慧，（E-mail）qhwlhwlh@126.com