薰衣草醇酰基转移酶基因（AAT）的克隆和表达分析

廖燕 尹松松 龚林涛 闫博文 孙明辉 苏秀娟 王爱凡

摘要：醇酰基轉移酶（AAT）可以催化乙酰辅酶A与萜烯醇类物质的结合，生成各类乙酸酯类化合物。为探明薰衣草AAT基因在酯类化合物合成中的调控作用，本研究以薰衣草品系杂花叶片为供试材料，利用反转录PCR技术克隆薰衣草AAT基因的cDNA序列，该cDNA序列长度为1 344 bp，其编码蛋白质由447个氨基酸组成，是非跨膜亲水性蛋白质，属于PLN02481超级家族；薰衣草AAT与黄色猴面花EgAAT亲缘关系最近，相似度为60.87%。AAT基因在苞叶中的表达量最低，在花瓣中的表达量最高；在花冠不同发育时期，该基因在盛开期表达量到达峰值。构建原核表达载体pET-28a-AAT，筛选了重组蛋白在大肠杆菌Transetta（DE3）中的最适诱导表达条件，诱导后获得的重组蛋白质相对分子质量为5.026×104，重组蛋白以包涵体形式存在，具有将芳樟醇催化合成乙酸芳樟酯的生物活性。本研究结果为进一步验证薰衣草AAT基因在酯类化合物合成过程中的功能提供了基础。

关键词：薰衣草；醇酰基转移酶基因（AAT）；克隆；表达模式；酶活性鉴定

中图分类号：S184文献标识码：A文章编号：1000-4440（2024）04-0599-08

Cloning and expression analysis of lavender alcohol acyltransferase gene （AAT）

LIAO Yan1，YIN Song-song1，GONG Lin-tao1，YAN Bo-wen1，SUN Ming-hui1，SU Xiu-juan1，2，WANG Ai-fan1，2

（1.College of Agronomy， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China;2.Lavender Research Institute of Xinjiang Agricultural University/Xinjiang Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement， Urumqi 830052， China）

Abstract：Alcohol acyltransferase （AAT） can catalyze the combination of acetyl coenzyme A and terpene alcohols to produce various types of acetate compounds. In order to explore the regulatory role of lavender AAT gene in the synthesis of ester compounds， the cDNA sequence of lavender AAT gene was cloned by reverse transcription PCR using the leaves of lavender strain Zahua as the test material. The length of the cDNA sequence was 1 344 bp， and the encoded protein was composed of 447 amino acids， which was a non-transmembrane hydrophilic protein and belonged to the PLN02481 superfamily. The AAT in lavender was closely related to the EgAAT in yellow monkey-faced flower， with a similarity of 60.87%. The expression level of AAT gene was lowest in bracts and highest in petals. At different developmental stages of corolla， the expression of this gene reached the peak at the full-bloom stage. Prokaryotic expression vector pET-28a-AAT was constructed. The optimal expression conditions of the recombinant protein in Escherichia coli Transetta （DE3） were screened. The relative molecular weight of the recombinant protein was about 5.026×104. The recombinant protein existed in the form of inclusion bodies and had the biological activity of catalyzing the synthesis of linalyl acetate from linalool. The results of this study provide a basis for further verifying the function of lavender AAT gene in the synthesis of ester compounds.

Key words：lavender;alcohol acyltransferase gene （AAT）;cloning;expression pattern;enzyme activity identification

薰衣草为唇形科薰衣草属，是一种珍贵的天然香料植物 [1]，不仅具有良好的观赏价值，其花穗中提取的精油也被广泛用于美容、烹饪和香料工业以及医药保健领域[2]。薰衣草精油主要由乙酸芳樟酯、芳樟醇等萜类物质组成[3-4]，乙酸芳樟酯是一种挥发性的芳香族单萜类化合物，具有清新、芳香的香气以及抗菌镇静等功效，是多种名贵植物精油的主要成分之一[5-6]。高等植物中大部分萜类物质来源于异戊烯二磷酸（Isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲丙烯二磷酸（Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）两个前体物质，它们主要通过细胞质途径（Mevalonic pathway，MVA）和质体途径（2-C-Methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP）合成[7]。IPP和DMAPP可以在醇酰基转移酶（AAT）的催化作用下合成各种类型的萜类化合物。醇酰基转移酶不仅可以催化异戊二烯和异戊烯醇的转化以及乙酰辅酶A与萜烯醇类物质的结合，还可以催化萜类化合物中的羟基和羧基等官能团的转化，从而生成异戊烯醇酯和各类乙酸酯类化合物，并调节萜类化合物的结构和生物活性[8-11]。

近年来，国内外对植物AAT基因展开了广泛研究，例如已从月季[12-13]、山木瓜[14]、草莓[15]、苹果[16]等植物中获得了AAT基因，并對其调控功能开展了大量研究。Shalit 等[12]从月季中获得的第一个AAT基因，可将月季中香叶醇、香茅醇等不同醇类底物催化合成对应的酯类化合物，该基因在月季花器官及盛开前期的转录水平达到最高峰值。李晋华[13]验证了月季RcAAT基因主要参与了乙酸香叶酯的合成。Cristian等[14]确定了山木瓜VpAAT1基因参与了木瓜香气的形成。董静等[15]发现转草莓FvAATW2基因的烟草可在发育早期合成酯类物质，转基因草莓果实中挥发酯含量显著提高。Li等[16]发现苹果MdAAT2基因参与了苹果酯类物质的合成。因此，AAT基因对植物香气成分的合成具有一定的调控作用。

目前关于薰衣草醇酰基转移酶基因的研究未见报道。本研究以高油薰衣草品系杂花叶片为材料，克隆并分析了薰衣草醇酰基转移酶基因AAT的脱氧核糖核酸（Complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）序列，分析了该基因在薰衣草花器官中不同组织以及花冠不同发育时期中的表达情况，筛选了目的基因的原核表达条件，并进行了蛋白质的体外酶活性检测，以期为进一步研究AAT基因在薰衣草酯类物质合成中的作用奠定了基础。

1材料与方法

1.1植物材料

以新疆农业大学农学院薰衣草试验地的杂花品系叶片为克隆模板材料，以新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克族自治州伊宁县薰衣草品系杂花为表达分析材料，花香检测用新鲜样品，其余样品于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2试验试剂

pET-28a载体由本实验室提供，实时荧光定量PCR试剂盒，TransZol Up，pEASY-T5载体，大肠杆菌DH5α感受态细胞，农杆菌GV3101感受态细胞，胶回收试剂盒，肉汤培养基（Luria-Bertani，LB），酵母提取物牛肉提取物（Yeast extract beef extract，YEB）液体培养基，LB、YEB固体培养基，卡那霉素，利福平，乙醇，三氯甲烷，异丙醇，限制性内切酶EcoR I、Hind Ⅲ，ProteinRuler I，ProteinRuler II，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（变性）粉末，10%SurePAGETM ，Ni-NTA蛋白纯化试剂盒，T4 DNA连接酶，乙酰辅酶A和芳樟醇，磷酸缓冲盐水（Phosphate-buffered saline，PBS）缓冲液粉末，大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞，氯霉素，质粒小提试剂盒。

1.3薰衣草AAT基因的克隆

采用TransZol Up试剂盒提取薰衣草总核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA），用反转录试剂盒将其合成cDNA。根据NCBI上公布的薰衣草醇酰基转移酶核苷酸序列（登录号：KM275343.1）设计特异性引物AAT-F和AAT-R（表1）。以cDNA为模板，扩增目的片段。反应体系：上游引物1 μl，下游引物1 μl，2.5 mmol/L dNTPs 5 μl，10×EasyPfu Buffer 5 μl，EasyPfu DNA Polymerase 1 μl，cDNA 1 μl，水 36 μl[17]。反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。将回收的目的DNA片段连接到pEASY-T5载体，转化大肠杆菌DH5α，经菌液PCR鉴定后的阳性克隆进行DNA测序。

1.4生物信息学分析

使用NCBI上的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）工具分析基因序列的ORF，确定克隆得到的薰衣草AAT基因序列是否具有编码蛋白质的潜力。使用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）对薰衣草AAT进行信号肽预测。使用COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）预测薰衣草AAT的卷曲螺旋结构。使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）分析薰衣草AAT的可能跨膜区。使用MEGA5对薰衣草AAT氨基酸序列进行比对，使用DNAMAN构建薰衣草AAT蛋白的系统进化树。

1.5表达模式分析

提取薰衣草品系杂花花器官不同发育时期以及不同组织部位总RNA，反转录合成cDNA，根据AAT基因序列设计实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物qAAT-F和qAAT-R，内参基因使用β-actin-F和β-actin-R[17]（表1），以提取的薰衣草cDNA为模板进行荧光定量PCR。每个样品设置3次重复，用2-△△Ct法分析荧光定量数据[18]。

1.6AAT重组蛋白的表达条件优化

载体使用本实验室保存的pET-28a。以从薰衣草叶片中克隆的pEASY-T5-AAT重组质粒为模板选择EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点，设计特异性引物pAAT-F和pAAT-R引物进行扩增（表1）。对酶切产物所需片段进行胶回收，纯化目的基因及线性载体，用T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α，将测序正确的菌液进行pET-28a-AAT质粒提取，转化Transetta（DE3），菌液培养至光密度（Optical density，OD）600值为0.4～0.6，异丙基β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导浓度分别为0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L，诱导时间分别为0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，诱导温度分别为25 ℃、28 ℃、37 ℃，筛选最佳诱导剂浓度、诱导时间和培养温度[19]。

1.7AAT重组蛋白体外酶活性检测

采用筛选获得的最佳诱导条件诱導薰衣草AAT蛋白表达。按照Ni-NTA琼酯糖纯化树脂说明书进行蛋白纯化。蛋白体外酶活性测定参照曹香梅[20]应用的方法，在含5 mmol/L乙酰辅酶A和10 mmol/L芳樟醇的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液[100 mmol/L Tris，pH 7.5，2 mmol/L 二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）]中，添加重组蛋白（500 ng/μl），30 ℃水浴 1 h，使用气相色谱-质谱联用仪（Gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）检测生成的产物。

2结果与分析

2.1薰衣草醇酰基转移酶基因AAT的克隆和序列分析

以薰衣草品系杂花的叶片cDNA为模板，扩增获得AAT基因（图1）。利用NCBI的ORF Finder分析AAT基因序列，该基因碱基序列长度为1 344 bp，其编码的蛋白质由447个氨基酸组成，相对分子质量为5.026×104，等电点为8.61。

在线程序预测发现，AAT蛋白无信号肽结构域，多肽链位于细胞膜外，无跨膜结构域存在，属于PLN02481蛋白超级家族，410位甘氨酸（Glycine，Gly）分值最小，为-2.989，亲水性最强；309位脯氨酸（Proline，Pro）分值最大，为2.111，亲水性最弱，预测该蛋白质为亲水性蛋白质。AAT蛋白的二级结构包含12个α-螺旋、16个β-折叠和29个无规则卷曲；蛋白质的三级结构中无规则卷曲较多，其结构与PLN02481-2super家族蛋白质的三级结构相似，推测该蛋白质和PLN02481-2super家族蛋白质的功能相似。

2.2薰衣草AAT蛋白氨基酸序列的多重比较和进化树分析

薰衣草AAT蛋白与克莱门氏小柑橘、甜橙、旋蒴苣苔、黄色猴面花、山荆子、苹果、杨梅、荷花、烟草、芝麻等10个物种AAT同源蛋白的氨基酸序列比对结果表明，这些序列均具有植物酰基转移酶（BAHD）家族特有的高度保守结构域HXXXD（165-169氨基酸残基）活性位点和附加的DFGWG（378-382氨基酸残基）结构域，同时也具有BAHD家族的保守结构域LXXYYPLAGR（74-83氨基酸残基）（图2）。因此，薰衣草AAT基因属于BAHD基因家族。

构建薰衣草（Lavandula x intermedia）与10个物种AAT蛋白的系统进化树，发现薰衣草AAT与黄色猴面花、旋蒴苣苔、芝麻、甜橙、克莱门氏小柑橘、杨梅、荷花、烟草、苹果、山荆子AAT的同源性分别为60.87%、60.05%、59.64%、59.49%、59.72%、59.77%、57.37%、57.4%、54.71%、56.01%，其中薰衣草AAT蛋白与黄色猴面花的蛋白相似性最高，为60.87%（图3），推测两者具有相似的分子功能。

2.3薰衣草AAT基因的表达模式分析

分析AAT基因在不同组织和花冠不同发育时期的相对表达量（图4），该基因在花瓣中的表达量最高，其次是花萼、雄蕊、叶片、雌蕊、苞叶；该基因在花冠花蕾期和初开期的表达量较低，半开期其表达量迅速上升，盛开期其表达量达到峰值，衰败期其表达量降低。

2.4薰衣草AAT基因原核表达载体的构建及鉴定

用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pET-28a载体和AAT基因，将回收的AAT基因片段与载体DNA片段连接构建重组载体pET-28a-AAT。双酶切电泳结果表明，酶切获取的小片段与AAT基因大小一致，大片段与pET-28a载体大小一致（图5），表明表达载体构建成功。

2.5薰衣草AAT重组蛋白的表达条件优化及可溶性鉴定

将重组表达载体pET-28a-AAT进行诱导表达。重组蛋白在0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L5个IPTG浓度下均能表达，当IPTG终浓度为0.6～0.8 mmol/L时重组蛋白表达量最高（图6A）；在2 h、4 h、6 h、8 h、10 h的诱导时长下均能表达，并且AAT蛋白的表达量与诱导时长呈负相关（诱导时间越长，表达量越低），当诱导时间为2 h时表达量达到最高（图6B）；在25 ℃、28 ℃、37 ℃不同温度下均能诱导目标蛋白表达，当温度为37 ℃，在0.6～0.8mmol/L的IPTG和2 h条件下重组蛋白表达量最高（图6C）；因此，选择IPTG浓度为0.6～0.8 mmol/L、诱导时间为2 h、培养温度为37 ℃作为该重组蛋白的最佳诱导表达条件。采用以上条件诱导获得的重组蛋白与目标蛋白相对分子质量大小一致（5.026×104，图7），该蛋白质以包涵体形式存在。

2.6薰衣草AAT蛋白的酶活性验证

将纯化后的AAT蛋白和芳樟醇混合后进行酶活性检测，当酶促反应进行至25.583 min时检测到了乙酸芳樟酯（图8），表明薰衣草AAT蛋白具有催化芳樟醇合成乙酸芳樟酯的生物活性。

3讨论

挥发性酯类化合物作为贡献薰衣草香气的重要组分，在薰衣草发育过程中不断积累，对于薰衣草精油的品质以及薰衣草相关产业的发展具有重要意义。本研究采用RT-PCR技术首次克隆了薰衣草AAT基因的全长cDNA。BAHD酰基转移酶家族中特有的HXXXD基序直接参与酶活性位点的催化作用，而DFGWG基序与蛋白质的稳定性、互动能力和信号转导过程相关[21-22]，推测薰衣草AAT蛋白也具有类似功能。AAT基因在植物中具有组织表达差异性。薰衣草AAT基因在花瓣中表达量最高，该结果与月季RhAAT1[12]、桂花OfAAT1及柿子DKAAT1的表达情况相似[23-24]。AAT基因在薰衣草花冠各个发育时期的表达量也不同。梅花PmCFAT1基因表达量随开花进程逐渐上升，在盛花期其表达量达到最高[25]。玫瑰RrAAT基因在半开期的表达量达到最高，自盛花期逐渐下降[26]。薰衣草AAT基因在盛开期其表达量达到峰值。薰衣草AAT基因在花器官不同发育时期的表达趋势与梅花PmCFAT1[25]的表达趋势一致，均为在盛开期表达量达到最高，和玫瑰RrAAT[26]自盛开期后下降的趋势一致。

通过体外酶活性试验鉴定目标蛋白的生物学功能，是确定相关基因是否参与调控酯类化合物合成的有效途径，而建立高效诱导表达体系则是该途径的前提条件。曹颖等[27]采用优化后的表达条件在大肠杆菌中高效表达了番茄SlAAT1，体外酶活性试验结果表明该蛋白质具有醇酰基转移酶活性。在细胞裂解过程中蛋白质很容易降解，但采用本身缺少蛋白质水解酶的Transetta（DE3）感受态细胞作为表达受体，则可保证重组蛋白不会被降解[28]。本研究采用优化后的表达条件在Transetta（DE3）细胞中诱导表达了以包涵体形式存在目的蛋白，出现表达的目的蛋白以包涵体形式存在的原因可能是大肠杆菌作为一种原核生物缺乏真核生物所具有的许多复杂的折叠和翻译后的加工机制，这些机制包括蛋白质转运、拆分和修复错误的二硫键等，由于缺乏这些机制，大肠杆菌中表达的目标蛋白常常会有错配的二硫键产生，而这种二硫键可能会导致蛋白质在细胞内无法正确定位或功能失调，从而导致目的蛋白形成包涵体[29-30]。对纯化后的目标蛋白进行体外酶活性检测，发现AAT蛋白具有催化芳樟醇合成乙酸芳樟酯的生物活性。

4结论

本研究从薰衣草杂花品系叶片中克隆得到醇酰基转移酶基因AAT，全长1 344 bp，编码447个氨基酸；对AAT蛋白氨基酸序列进行多序列比对结果显示，该序列属于BAHD家族，系统进化树分析结果表明AAT蛋白与黄色猴面花AAT亲缘关系最近。AAT基因在苞叶中的表达量较低，在花瓣中的表达量相对较高，在花器官不同发育时期，AAT基因的表达呈先升高后降低的趋势。重组蛋白表达最适诱导条件为：IPTG浓度0.6～0.8 mmol/L、诱导时间2 h、培养温度37 ℃，对包涵体蛋白进行纯化复性发现其具有催化芳樟醇合成乙酸芳樟酯的生物活性。本试验结果为进一步验证AAT基因在薰衣草酯类物质合成中的作用奠定了基础，为今后利用基因工程手段培育精油产量高、品质优的薰衣草新品种提供了候选基因。

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（责任编辑：蒋永忠）

收稿日期：2023-04-27

基金项目：新疆维吾尔自治区重大科技专项（2022B02036-1）；国家自然科学基金地区科学基金项目（31760429）；新疆维吾尔自治区科学技术厅“天山青年计划”优秀青年科技人才培养项目（2020Q016）；国家级大学生创新训练计划项目（201810758003）；作物学重点学科发展基金项目（XNCDKY2021015）

作者简介：廖燕（2000-），女，重庆人，硕士研究生，主要从事薰衣草遗传育种研究。（E-mail）1642101080@qq.com

通讯作者：苏秀娟，（E-mail）smm1980@yeah.net;王爱凡，（E-mail）wangaifantop@163.com