线粒体DNA介导先天免疫反应在肠缺血再灌注损伤中的研究进展

景祎馨 张贻帼 潘 锐 丁 可 孟庆涛

肠缺血再灌注 (intestinal ischemia reperfusion, IIR) 损伤是临床常见的一种损伤,可发生在多种病理生理条件下,例如急性肠系膜缺血、严重创伤、急性休克、小肠移植和败血症。在缺血期间,组织缺氧导致内皮细胞屏障功能受损和血管通透性增加,随后在再灌注期间血流和氧气的恢复导致细菌易位、组织损伤、炎性反应和氧化应激。除肠道局部损伤外,IIR还可引起肠道菌群移位、内毒素血症及远端器官损害,最终导致全身炎症反应综合征、多器官功能障碍综合征甚至死亡[1]。

IIR损伤的病理进程中,线粒体已经成为关键的参与者和调节者。线粒体作为大多数真核细胞内必不可少的细胞器,主要通过氧化磷酸化产生ATP供应能量。线粒体拥有独立于细胞核的遗传物质——线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA),人类的mtDNA由高度保守的轻链及重链组成环状结构,共编码了氧化磷酸化相关的13种mRNA、2种rRNA以及22种tRNA[2]。内共生学说认为线粒体来源于真核生物吞噬的细菌,因此mtDNA与细菌基因具有结构的相似性,释放到细胞质或循环中的mtDNA可作为“外来”分子被先天免疫系统中不同模式识别受体识别,从而触发Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)及促炎反应[3]。本文讨论了mtDNA释放到胞质或循环中的可能机制,重点关注了mtDNA触发的免疫反应在IIR损伤的作用,主要涉及Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)、环状GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP,cGAS)和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)信号通路。

一、mtDNA的跨膜释放机制

1. mtDNA胞质释放机制:在生理情况下,mtDNA主要存在于线粒体基质内,缺氧、败血症、外伤或线粒体膜电位剧烈变化等刺激可造成mtDNA穿越线粒体膜而转移到胞质中,这个过程与线粒体膜的结构与功能密不可分[3]。目前已有研究显示多种线粒体膜孔道参与了mtDNA的胞质易位。

(1)线粒体通透性转换孔:线粒体通透性转换最初由Haworth和Hunter提出,他们发现高水平的钙会引起线粒体内膜通透性的增加[4]。随着进一步研究证实,这一现象由一种组装在线粒体膜上的分子实体支持——线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP),该孔道直径为2～3nm,可允许水及小于1.5kDa的溶质通过[5,6]。

mPTP开放除了允许代谢物流出外,也可介导mtDNA的释放。线粒体在受到Fe2+、H2O2和钙离子诱导的氧化应激刺激下,mtDNA的部分片段会通过mPTP离开线粒体[7]。同样在小鼠脑线粒体中发现,辐射诱导的氧化应激会引起mtDNA氧化损伤及片段化,而且还会使mPTP自发打开和关闭的频率增加,促进mtDNA片段易位到细胞质[8]。mPTP介导的mtDNA的胞质释放在多种炎性疾病中得到广泛研究。在肌萎缩性侧索硬化症模型中,一种核DNA/RNA结合蛋白TDP-43可错位进入线粒体,打开mPTP导致mtDNA泄漏到细胞质中,从而进一步驱动cGAS介导的免疫信号[9]。

(2)BAK/BAX孔:Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡的关键调控因子,目前已发现18种同源蛋白,其中BAX与BAK是关键的促凋亡蛋白[10]。在生理情况下,BAX和BAK主要以无活性的单体形式存在,但在细胞凋亡进程中,BAX/BAK会发生积聚并插入线粒体外膜,经历构象重排与低聚等过程形成孔道,释放细胞色素c等促凋亡因子以激活半胱天冬酶级联反应,最终导致细胞收缩、染色质缩合和凋亡体形成[11]。

线粒体外膜形成的BAX/BAK孔隙不仅仅参与细胞凋亡的激活,近年来研究显示,BAX/BAK孔介导的mtDNA释放可激活先天免疫信号的转导。使用晶格光片活细胞显微镜观察凋亡细胞线粒体发现,线粒体外膜出现的BAK/BAX孔可允许携带mtDNA的线粒体内膜膨出,随后线粒体内膜发生透化释放mtDNA进入胞质[12]。在膜孔道的组装过程中,BAX与BAK会形成单独的线、弧和环状结构,这些弧和环状结构与膜孔的形成密切相关。此外BAX与BAK之间可进行相互调节,促进彼此组装,两者的组装速率是mtDNA释放动力学的主要决定因素[13]。

(3)电压依赖性阴离子通道:电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)是线粒体外膜上嵌入的β-桶状蛋白,控制着线粒体代谢物质的进出。VDAC可以在氧化应激条件下发生低聚,并且VDAC的低聚体可以形成大的线粒体外膜透化孔。在活细胞中,VDAC1或VDAC3的低聚都有助于线粒体外膜透化并促进mtDNA的释放,此外,高效的VDAC1低聚化抑制剂VBIT-4抑制了mtDNA的流出。VDAC1的N端结构域包含3个带正电荷的残基可以与mtDNA的负电荷骨架相互作用,同时mtDNA可能会进一步促进VDAC1寡聚化,两者之间的相互作用可进一步促进VDAC低聚并增加mtDNA释放[14]。

2.mtDNA细胞外空间释放机制:mtDNA可以释放到细胞外,在血浆和血清、脑脊液或滑液等多种体液中都观察到了循环mtDNA的存在,循环中存在的mtDNA水平与炎症性疾病、癌症、衰老、创伤或组织损伤密切相关[15]。

(1)细胞外陷阱:以中性粒细胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)为例,NET是中性粒细胞激活后释放到胞外的网状超微结构,主要由DNA骨架及附着的颗粒蛋白及肽类组成,NET可以直接捕获致病微生物,是抵御微生物入侵机体的一道防线[16,17]。尽管NET中的大部分DNA来自细胞核,但这些结构中也包含mtDNA[18]。有研究显示,激活后的中性粒细胞会以ROS依赖性方式释放仅含有mtDNA的NET[19]。与NET类似,巨噬细胞可以产生由mtDNA组成的巨噬细胞外陷阱,从而抵御微生物入侵及扩散[20]。同样在嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞中也发现含有mtDNA的细胞外陷阱形成[21,22]。

(2)细胞外囊泡:细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)是一种细胞膜衍生结构,通常分为外泌体、微泡和凋亡小体3个亚型[23,24]。EV可以携带特定的蛋白质、脂质或基因片段,在细胞间成分交换与信号转导等方面发挥着重要作用[25]。在慢加急性酒精性肝损伤中,循环中含有mtDNA的EV的水平增加,并且与中性粒细胞增多症和肝毒性密切相关。在慢性心力衰竭患者,血浆来源的携带mtDNA的外泌体增加可通过TLR9途径引发炎性反应,并且这种炎症的作用程度与外泌体mtDNA拷贝数密切相关[26]。同样,在抗磷脂抗体刺激后,含mtDNA的EV水平会增加可通过TLR9受体引起内皮细胞的活化,从而增加先兆子痫的风险[27]。

二、IIR损伤中mtDNA介导的先天免疫信号通路

线粒体是缺血再灌注病理进程的重要参与者和调节者,线粒体功能障碍会通过氧化应激,炎症和凋亡加剧IIR损伤。在IIR期间,受损的线粒体所释放mtDNA是内源性损伤相关分子模式的重要来源,可激活TLR9,cGAS和NLRP3等先天免疫的传感器以增强促炎和Ⅰ型干扰素反应[28]。

1.TLR9:TLR9 是第一个发现对胞质DNA有反应的特异性受体,TLR9位于内质网中,可以识别DNA的低甲基CpG序列,mtDNA的低聚化CpG序列是TLR9的有效激活剂[29]。与DNA结合后,TLR9会通过衔接蛋白MyD88发出信号,在核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的存在下激活促炎性细胞因子的转录,此外还可通过干扰素调节因子7的磷酸化导致Ⅰ型干扰素基因的激活[30]。

TLR9已被证明在肝脏IR期间的加剧先天免疫反应,而TLR9的抑制可扭转肝脏损伤[31]。有研究发现,在肝细胞受到凋亡刺激时,Bak/Bax孔介导的mtDNA释放会诱导TLR9依赖性IFN-β产生。此外,在急性肺损伤中mtDNA可以通过激活TLR9/NF-κB通路介导随后的炎性反应[32]。在肠组织中,创伤导致的细胞破坏可以释放mtDNA至循环中,通过激活中性粒细胞TLR9受体介导促炎性细胞因子的释放加剧肠道功能障碍[33,34]。但矛盾的是,Slone等[35]通过对TLR9基因敲除小鼠进行IIR后,检查肠组织损伤及炎性相关指标后发现TLR9在IIR诱导的组织损伤及炎症中似乎是可有可无的。因此,mtDNA触发TLR9信号转导的炎性反应可能有组织器官差异性,仍需要进一步研究。

2.cGAS:大量研究已经证实,cGAS信号轴可响应外源或內源DNA刺激而调节Ⅰ型干扰素的产生。在没有DNA刺激的情况下,cGAS会以自抑制状态存在。当cGAS检测到DNA后可利用GTP和ATP作为底物,催化第二信使cGAMP的合成,随后cGAMP与位于内质网的干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)结合并诱导构象变化,活化的STING与TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)结合,进而磷酸化干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3),随后IRF3二聚化并易位到细胞核。此外STING还可招募并激活IκB激酶,从而诱导NF-κB易位到细胞核,进入细胞核的NF-κB与IRF3可以与其他转录因子一起发挥作用,诱导干扰素和炎性细胞因子的表达。

尽管激活cGAS的大多数内源性DNA都认为来源于核基因,但目前有多项研究证实,mtDNA也可用作为cGAS配体。Guo等[36]研究显示,向玻璃体内注射mtDNA可导致细胞损伤和视网膜功能障碍,这一机制主要与mtDNA激活cGAS-STING通路诱导炎性反应密切相关。此外,在牙本质细胞炎症及肾损伤等疾病中也观察到mtDNA-cGAS-STING通路激活。在有关IIR的研究中,cGAS-STING信号转导参与了mtDNA诱导的坏死性凋亡,mtDNA可通过诱导坏死性凋亡进一步促进IIR损伤,而STING敲除可改善mtDNA诱导的肠道损伤。此外,mtDNA-cGAS-STING的激活可通过诱导过量脂质过氧化而加重肠道损伤,在该研究中,mtDNA可以以剂量和时间依赖性的方式诱导脂质过氧化和细胞死亡,这一过程可通过STING的敲除而逆转。

针对mtDNA-cGAS-STING信号轴的靶向治疗可显著减轻IIR损伤。使用线粒体靶向抗氧化剂减轻DNA损伤或DNase-1降解细胞外DNA可以有效改善IIR损伤。STING作为通路关键调节蛋白,STING的敲除可有效改善IIR中mtDNA引起的损伤,此外,STING的抑制剂已经在小鼠肾缺血再灌注保护中得到广泛应用,因此STING在IIR预防及治疗的作用值得进一步探究。

3. NLRP3:NLRP3是一种NLR家族的关键受体蛋白,NLRP3的激活可吸引ASC和caspase-1组装成炎性小体,从而诱导caspase-1自切割和活化。活化的caspase-1一方面促进IL-1β和IL -18等炎性细胞因子的成熟和分泌,另一方面还可切割GSDMD引发焦亡,最终导致缺血再灌注的损伤。NLRP3激动剂不仅包括病原体相关的RNA、DNA、成孔毒素和肽聚糖,mtDNA也是NLRP3的有效激动剂。

既往研究提出,氧化的mtDNA易位到胞质后可直接导致NLRP3炎性小体激活,增加IL-1β的分泌。Xian等[37]进一步验证了在线粒体中,氧化的mtDNA要么被DNA糖基化酶OGG1修复,要么被内切酶FEN1切割成500～650bp片段,这些片段通过mPTP和VDAC依赖性通道离开线粒体以启动胞质NLRP3炎性小体活化,并导致了促炎性细胞因子的释放。尽管目前缺乏IIR损伤中mtDNA激活NLRP3炎性小体的直接证据,但已有多项研究证实NLRP3炎性小体在IIR期间的损伤作用。一方面,NLRP3可以以GSDMD依赖性方式诱导焦亡加剧IIR损伤,另一方面,NLRP3活化所介导的炎性细胞因子生成也促进了IIR损伤。

mtDNA-NLRP3通路激活是IIR损伤的可能机制之一。研究显示,VX-765作为一种选择性caspase-1抑制剂,可有效抑制NLRP3炎性小体活化,VX-765预处理可以有效减轻IIR期间的氧化损伤及炎性反应。此外,靶向mtDNA氧化损伤及释放也可有效推进IIR损伤治疗进展。特异性内切核酸酶1可将氧化的mtDNA切割成小分子片段,其抑制剂FEN1-IN-4可减少mtDNA碎片化,mPTP抑制剂CsA与VADC孔抑制剂VBIT-4可有效减少mtDNA向胞质释放,而上述抑制剂在小鼠模型中均有效抑制了下游NLRP3炎性小体活化及炎性细胞因子释放,减弱了组织损伤,但未来仍需要进一步的实验验证其临床可行性。

四、展 望

IIR常见于急性肠系膜缺血、创伤、感染性休克、烧伤以及外科操作等,线粒体与肠缺血再灌注损伤的发生、发展密切相关。研究发现线粒体的生理功能不单单局限于能量的生成,在外界或自身刺激下,线粒体自身基因组mtDNA可作为一种损伤相关分子模式激活TLR9、cGAS及NLRP3信号通路,诱导干扰素及炎性细胞因子的释放从而进一步加重IIR。在这个过程中,mtDNA必须跨越线粒体内外膜才能到达线粒体外,其可能的机制主要包括了以mPTP、BAK/BAX 孔和VDAC孔为主的胞质释放途径,以细胞外陷阱及EV为主的胞外释放途径,但目前有关mtDNA释放通路的具体机制尚未完全阐明。此外,释放后的mtDNA如何特异性筛选并结合模式识别受体也有待于进一步研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。