基于VSMCs在腹主动脉瘤发病机制中的研究进展

余玉勇 王 成 陈世玖

主动脉瘤(aortic aneurysm, AA)是血管壁永久性、局限性的扩张,是继动脉粥样硬化之后第二大最常见的主动脉疾病,占总体死亡原因的第9位[1]。腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)是由多种病因引起并发生于肾动脉以下最常见的主动脉瘤疾病,起病隐匿而无明显临床症状,破裂后病死率极高,严重威胁患者的生命健康。目前,开放手术或主动脉腔内修复术(endovascular aortic repair, EVAR)是预防AAA破裂的主要治疗手段,尚未发现可以防治AAA药物应用于临床[2]。

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)是血管壁中膜的主要细胞成分,其结构和功能的改变通过破坏血管壁的完整性,促进AAA的发病[3]。尽管AAA的发病机制复杂,但这种血管疾病的发展突出表现为VSMCs的逐渐丧失、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)活性增加及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)降解、炎症显著、表型转换、活性氧水平升高、自噬缺陷和衰老增加[4, 5]。因此,全面深入地认识VSMCs的病理改变和调控机制在AAA发生及发展过程中的影响,有助于发现治疗这种血管疾病的更多有效的药物新靶点,对于在更早的时间点延缓或阻止AAA发展具有相当大的希望。

一、AAA中VSMCs的表型转换

健康的VSMCs保持收缩/静止(分化)表型,在响应外界环境刺激下诱导转变为合成/增殖(去分化)表型。收缩表型VSMCs功能是保持血管的弹性并确保它们的收缩以维持血管张力,VSMCs表型转换导致血管收缩功能的丧失,进而改变血管张力并增加主动脉壁应力以促进AAA的形成。

1.转录因子对VSMCs表型调控:VSMCs自身一系列特异性收缩基因表达的标志蛋白,包括平滑肌22α、SM-钙调蛋白、α-肌动蛋白-2,转录过程主要受心肌素(myocardin, MYOCD)和血清反应因子(serum response factor, SRF)的调控[6]。MYOCD与含有顺式作用元件(CArG盒)靶基因上的SRF结合,通过转录激活下游多种特异性收缩基因和表达高水平的收缩蛋白以维持VSMCs收缩表型。相反,Krüppel样因子4(kruppel-like factor 4, KLF4)作为一种关键转录因子,其通过直接与G/C阻遏元件结合或抑制SPF和CArG盒结合等多种机制促进VSMCs收缩表型转变为合成表型[7]。Wang等[8]研究表明,调控KLF4依赖性VSMCs表型转换可以减轻血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)诱导的小鼠AAA。该研究指出,体外瞬时受体电位香草素5(the transient receptor potential vanilloid-5, TRPV5)过表达下调了VSMCs中KLF4表达,同时使AngⅡ诱导的VSMCs收缩蛋白水平下降及收缩表型向合成表型转变。此外,与对照组比较,体内AngⅡ诱导ApoE-/-小鼠AAA的发生率及腹主动脉最大直径在TRPV5治疗后显著降低。因此,针对这种转录因子对VSMCs表型转换的调控机制,可能有助于今后AAA治疗上的临床应用。

2.非编码RNA对VSMCs表型调控:非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是指不编码蛋白质的RNA,它的功能主要是通过调控表观遗传、转录及转录后过程而影响基因的表达。随着研究的不断深入,多种ncRNA在调控VSMCs表型转换的作用逐渐被发现。微小RNA(microRNA, miRNA)是短的单链ncRNA,其功能是通过降解信使RNA或模仿小干扰RNA来抑制翻译和负调节基因表达。研究发现,miR-126-5p可以直接靶向抑制VEPH1在VSMCs中的表达,促进收缩型VSMCs的转换,进而限制AngⅡ诱导的ApoE-/-小鼠AAA直经的扩张[9]。同样,在AngⅡ诱导的ApoE-/-小鼠AAA模型中,miR-23b也被证实具有抗AAA作用。miR-23b通过靶向抑制转录因子叉头盒O4(forkhead box protein, FoxO4)在VSMCs中表达,促进收缩型VSMCs的转换,从而维持血管稳态,限制AAA的扩张[10]。刘雪琼等[11]研究还发现,miR-135b-5p过表达促进了脂多糖诱导的VSMCs的增殖及迁移,附子多糖和脂多糖共处理VSMCs后miR-135b-5p蛋白表达显著下降,表明了附子多糖可能通过靶向抑制miR-135b-5p进而阻碍VSMCs向增殖表型转换。此外,其他miRNA也参与VSMCs表型调控,如miR-143/145缺乏促进VSMCs锁定在合成表型中,miR-24、miR-26a、miR-146a和miR-221/-222的表达可诱导VSMCs向合成/增殖表型转变[12]。

此外,长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)也被确定为VSMCs表型的调节因子,其作用机制目前尚不完全清楚,可能充当miRNA的“海绵”降低其对信使RNA的调节作用。研究发现,lncRNA SMILR可以通过调节有丝分裂CENPF mRNA驱动细胞周期进程,进而促进VSMCs增殖[13]。同样,Cheng等[14]研究指出,膜联蛋白A2(annexin A2, ANXA2)通过促进核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B, NF-κB)p65的磷酸化,并与p65共易位进入细胞核导致VSMCs增殖、迁移和去分化,lncRNA LINC0028作为ANXA2上游的负性调节因子通过抑制ANXA2/NF-κB p65信号通路参与VSMCs表型转换的调节。此外,CARMN、PEBP1P2、ANRIL及PVT1等其他lncRNA也被认为对 VSMCs表型转换发挥重要调节作用。

以上这些表达异常的ncRNA通过促进或抑制VSMCs的表型转换影响AAA的发生及发展,其具体调控机制目前并不明确,尚需开展进一步实验研究。但可以确定的是,阻碍VSMCs向去分化表型转换有助于维持血管弹性及血管张力,进而抑制 AAA的进展。

二、AAA中VSMCs的氧化应激

氧化应激定义为活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平异常升高,并通过多种机制促进AAA的发育。研究发现,人类AAA中ROS过量产生的主要来源是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX)和解偶联内皮一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase, eNOS),ROS物质通过引起VSMCs炎症、MMPs激活和细胞凋亡来促进AAA的发展[15～17]。Siu等[15]在一项将hph-1小鼠与NOX1、NOX2、NOX4及p47phox敲除小鼠杂交以产生双突变体研究中,发现减少的超氧化物通过提高决定eNOS偶合/解偶联开关的关键辅助因子四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, H4B)和NO的生物利用度,并保留内皮二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)的表达和活性重新偶合了eNOS,证实了NOX通过调节eNOS偶联状态以介导AAA的形成。此外,在动脉瘤患者中发现两种人类NOX4突变体N129S和T555S与增加H2O2的产生有关,分析表明了NOX4可能通过产生更多H2O2作为中间体诱导内皮DHFR缺乏和eNOS解偶联。该研究虽未阐明不同NOX异构体在AAA发病机制中的潜在相互作用,但抑制NOX信号来恢复eNOS偶联活性机制为防治AAA提供了新线索。此外,在将AngⅡ输注到DHFR基因敲除小鼠体内的研究中,发现DHFR缺乏/eNOS解偶联/线粒体功能障碍级联参与了介导AAA的形成,用Mito-Tempo体内清除线粒体ROS在消除AAA的发展上完全有效,表明靶向线粒体ROS可能作为治疗与内皮DHFR 缺乏和eNOS解偶联相关的AAA新治疗选择[16]。

近年来,有研究证实了TGF-β/NOX4/DHFR/eNOS解偶联/TGF-β轴是在马方综合征胸腹主动脉瘤形成中的新前馈通路,抗TGF-β和叶酸靶向此轴的前馈信号可减弱Fbn1C1039G/+小鼠主动脉瘤的形成[18]。以上研究均表明了氧化应激是介导AAA形成的一个重要病理过程, NOX、DHFR、eNOS解偶联、线粒体功能障碍四者之间的调控机制为AAA的防治开辟了一个新的研究方向。

有研究发现,AngⅡ诱导的小鼠主动脉VSMCs NOX4水平增加直接促进了基因工程转基因小鼠主动脉扩张,并表明了这种过度的氧化应激可能部分通过上调骨桥蛋白促进了AAA的进展[19]。此外,Hsu等[20]利用一氧化碳释放分子2抑制人VSMCs NADPH氧化酶和线粒体衍生的ROS产生,逆转了由Ang Ⅱ诱导的IL-6/Jak2/Stat3 途径相关的血管壁炎症及减少MMPs水平,进而防止了AAA的进展。尽管这些研究中ROS如何产生以及ROS如何影响VSMCs生物学的实际机制尚不完全清楚,但过量的ROS会导致VSMCs功能障碍以及随后AAA发展中的主动脉壁破坏。因此,VSMCs氧化应激调控的分子机制也是AAA研究中又一值得关注的领域。

三、AAA中VSMCs炎症和MMPs

1.VSMCs炎症:AAA是以各种细胞因子及MMPs过表达为特征的慢性炎性疾病。炎症总是存在AAA病变中,作为对血管损伤的免疫反应,肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、B细胞及T细胞等免疫细胞均被证明参与了AAA形成[21]。然而,VSMCs本身不是典型的炎性细胞,在应激状态下(如衰老、高血压、动脉粥样硬化)可被激活成具有和单核-吞噬细胞相似的功能,通过分泌多种促炎性细胞因子(如IL-6、MCP-1、IL-1β和TNF-α)和趋化因子将炎性细胞募集到主动脉壁进一步加重主动脉壁局部炎症,促进AAA的进展。据报道,哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、JAK/STAT、NF-κB、TGF-β/Smad、平滑肌特异性NOX4及SMARCD1偏码基因BAF60a等信号通路的激活促进了VSMCs炎症和主动脉瘤进展,而过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)、Rho GTPase激活蛋白18和Nrf2-Keap1信号等在内的信号通路通过抑制促炎型VSMCs表型减轻血管炎症和防止AAA进展[5,19,22,23]。虽然VSMCs炎症与AAA联系的具体机制难以捉摸,但以上研究充分说明这些信号通路在驱动或抑制VSMCs炎症的作用,了解这些信号通路对VSMC炎症调控机制将可能作为预防和治疗AAA的潜在治疗靶点。

2.VSMCs中的MMPs:在健康血管中,VSMCs产生的弹性蛋白和胶原蛋白以抵抗血管舒张和破裂,并通过协调MMPs/TIMPs比率来控制ECM的完整性和降解。TIMPs作为MMPs的特异性抑制剂,对AAA的进展起到重要保护作用。然而,处于合成型的VSMCs通过抑制TIMPs表达而增加MMPs活性,诱导ECM中弹性蛋白和胶原蛋白降解,导致主动脉壁退化,促进AAA的形成和最终破裂[3]。目前,来自VSMCs的几种MMPs(包括MMP1、2、9、13和14)对弹性蛋白和胶原蛋白发挥蛋白水解活性,在AAA发生、发展中促进ECM降解和削弱主动脉血管壁是必不可少的[12]。

四、AAA中VSMCs衰老和自噬

1.VSMCs衰老:研究发现,衰老的VSMCs可以释放多种促炎性细胞因子和基质降解分子,如MCP-1、IL-6 和MMP2,促进 AAA的形成[24]。AAA患者来源的VSMCs检测到老化细胞及衰老相关蛋白p21、p16表达均显著升高,烟酰胺磷酸核糖转移酶通过阻碍VSMCs老化发挥抑制AAA进展作用[25]。这些研究表明了衰老的VSMCs更容易受到病理刺激,导致老年患AAA的风险增加,延缓VSMCs衰老可能作为防治AAA的一种有效手段。

在哺乳动物中广泛表达的sirtuins家族,由Sirt1～7 7个成员组成,被认为是目前抗衰老治疗最有希望的靶点。在人类AAA样本和老年小鼠腹主动脉中观察到Sirt1的表达和活性明显降低,对VSMCs特异性Sirt1敲除和转基因小鼠研究均表明,Sirt1通过抑制AngⅡ和CaCl2诱导AAA小鼠模型中的p21和 NF-κB途径显著减弱血管细胞老化和炎症,从而阻碍AAA的形成[26]。同样,Tao等[27]研究指出,miR-199a-5p过表达通过靶向抑制VSMCs Sirt1加重了AngⅡ诱导的VSMCs衰老,并分析表明AngⅡ激活的miR-199a-5p/Sirt1通路可能是诱导VSMCs衰老和AAA的形成新分子机制。该研究并未排除AAA患者中其他上调的miRNA是否介导VSMCs衰老,对于介导VSMCs衰老的潜在机制还需多角度进行深入探讨。

2.VSMCs自噬:自噬是细胞代谢和稳态的关键调节因子,在维持正常的血管细胞功能方面发挥着关键作用。研究发现,通过特异性敲除VSMCs中自噬蛋白7(autophagy protein 7, ATG7)加剧了AngⅡ治疗后小鼠腹主动脉重塑[28]。此外,自噬在AngⅡ诱导的主动脉瘤VSMCs中被激活,敲除VSMCs中自噬蛋白5(autophagy protein 5, ATG5)减少了自噬体的产生,同时增加了VSMCs细胞凋亡及AngⅡ诱导动脉瘤小鼠模型中的血管炎症[29]。这种特异性敲除VSMCs自噬蛋白机制,表明了自噬对于维持VSMCs的稳态至关重要。

五、AAA中VSMCs凋亡

VSMCs凋亡削弱了它们产生结缔组织和修复弹性蛋白断裂的能力,导致主动脉壁薄弱,促进了AAA的发生、发展。因此,阐明介导VSMCs的凋亡途径可能为开发靶向VSMCs的药物以及维持患病主动脉中正常的VSMCs数量和功能提供帮助。

1.VSMCs细胞凋亡:细胞凋亡是由线粒体凋亡途径(内在途径)和死亡受体(外在途径)介导的一种进化上保守的细胞死亡途径。VSMCs是血管壁的主要细胞构成成分,AAA形成过程中VSMCs细胞凋亡是主动脉壁VSMCs丢失的主要原因,抑制VSMCs细胞凋亡将是治疗AAA的重要关注事件。

研究发现,TIMP-3通过靶向抑制p38信号通路的激活介导的人VSMCs细胞凋亡,促进人VSMCs细胞增殖能力,在AAA形成过程中发挥保护作用[30]。同样,发现 2-羟丙基-β-环糊精(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, HPβCD)通过激活自噬主要调节因子转录因子EB(transcription factor EB, TFEB)依赖性方式上调Bcl-2,抑制了β-氨基丙腈和AngⅡ诱导的VSMCs细胞凋亡,阻碍了AAA的发生、发展[31]。此外,在研究ncRNA在调节VSMCs凋亡和AAA发展中的作用时发现,lncRNA H19通过将转录因子特异性蛋白1募集到启动子区域来诱导HIF-1α的转录,后者表达增加促进了AngⅡ和猪胰弹性蛋白酶诱导的AAA动物模型中VSMCs凋亡,而敲低H19可以有效抑制这种影响[32]。同时,H19还可直接与miR-148b相互作用并抑制其表达,从而调节ox-LDA刺激的人主动脉VSMCs中的Wnt/β-catenin信号通路并发挥抗细胞凋亡作用[33]。近年来一项研究表明,circ-0092291过表达通过靶向miR-626/COL4A1信号轴来抑制AngⅡ诱导的人主动脉VSMCs细胞凋亡、减轻血管炎症和ECM降解,进而改善AAA进展[34]。尽管ncRNA亚类在动物模型和人体样本中调节VSMCs细胞凋亡的机制不同,并且这些亚类在很大程度上仍未得到研究,但这些研究发现强调了VSMCs细胞凋亡是AAA发展中的一个重要病理事件。

2.VSMCs坏死性凋亡:坏死性凋亡是另一种程序性细胞死亡,是AAA发展过程中VSMCs数量减少的另一细胞死亡机制。这种机制被认为是通过死亡受体的配体(如细胞因子)激活受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIP1)的激酶活性,后者介导RIP3和MLKL两种关键的坏死性凋亡下游介质的激活,进而诱导细胞死亡。研究发现,在人类AAA样本和弹性蛋白酶诱导的AAA小鼠模型中,介导坏死性凋亡的关键蛋白RIP1、RIP3表达水平升高(尤其是VSMCs层明显),使用necrostatin-1抑制RIP1或RIP3基因缺失可改善弹性蛋白酶诱导小鼠模型AAA的疾病进展,表明了RIP1/3 是主动脉VSMCs坏死性凋亡的诱导剂[35]。此外,Zhou等[36]研究指出,混合谱系激酶结构域样假激酶(mixed lineage kinase domain-like pseudokinase, MLKL)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)两者的激活在体内外均参与了RIP3依赖性介导VSMCs坏死性凋亡。该研究发现,MLKL和CaMKⅡ在CaCl2诱导的小鼠AAA模型中均被磷酸化,通过沉默MLKL观察到CaMKⅡ的磷酸化受抑制,表明MLKL可能作为CaMKⅡ的上游信号参与AAA的发病机制。此外,通过TNF-α加zVAD处理诱导的VSMCs坏死性凋亡,进一步分析表明,这种细胞死亡结果是通过激活RIPK3-MLKL-CaMKⅡ信号轴介导的。尽管知识有限,但人们越来越关注靶向细胞死亡途径作为AAA治疗的新方法。

六、展 望

AAA的发病过程是一个复杂、动态的过程,是主动脉疾病重要的死亡原因。遗憾的是,没有特定的药物可以预防或逆转AAA在临床试验中被证明是有效的。目前,手术治疗是预防主动脉瘤破裂唯一的手段,但又具有患者进行手术的可行性、术后相关并发症等不同的局限性,仅靠手术治疗远非理想。在人和动物模型的AAA病变研究中,主动脉血管突出表现为VSMCs的逐渐丧失、表型转换、ROS水平升高、炎症显著、MMPs活性增加、自噬缺陷及衰老增加,这些病理机制之间甚至相互串扰共同促进AAA的发生、发展,抑制这些病理改变恢复VSMCs结构和功能对于延缓或阻止AAA的进展具有重要作用。然而,虽然大量关于VSMCs病理改变及相关信号通路的研究为AAA的防治提供了多方向的策略与药物设计靶点,但许多详细机制仍然来自动物模型,考虑不同动物模型与人类状况和病理生理学的相关性差异,如何全面克服这些不足,在今后治疗AAA的临床应用中仍然是一个挑战。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。