中等强度有氧运动预干预下调小鼠骨骼肌TNF-R1水平并抵抗阿霉素诱导的骨骼肌萎缩

陈梦洁　段锐

关键词：有氧运动；阿霉素；骨骼肌萎缩；TNF-α；TNF-R1

文章编号：1001-747X（2024）01-0099-13 文献标志码：A 中图分类号：G804.23

DOI：10.16063/j.cnki.issnl001-747x.2024.01.010

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一种被广泛用作治疗肿瘤的化学药剂。尽管其对抑制肿瘤生长效果显著，但同时，它产生的毒性可危及心脏、骨骼肌等。骨骼肌暴露于阿霉素环境中会诱发显著的骨骼肌损伤，具体表现包括骨骼肌质量下降、功能衰退及疲劳增加等。

在临床上为了缓解阿霉素等化疗药物对健康组织带来的毒性，已有多种方式被提出用于缓解阿霉素的副作用，其中运动作为一种非药物疗法，已有大量临床前动物实验及临床人体研究证明运动能有效影响阿霉素诱发的骨骼肌毒性。但是，运动抵抗阿霉素诱导骨骼肌毒性的机制尚未明晰。现有研究发现，运动能通过影响氧化应激反应、蛋白质合成与降解间的动态平衡等多种途径改善阿霉素诱导的骨骼肌萎缩。

Gilliam等人发现阿霉素给药会导致膈肌中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）及其受体1（tumor necrosis factor receptor 1，TNF-R1） mRNA及蛋白表达水平显著升高。TNF-α与TNF-R1结合可通过半胱天冬酶途径诱导细胞凋亡，尤其会特异性诱发Caspase-8（cysteinyl aspartate specific proteinase-8）的裂解激活以诱导细胞焦亡；另一方面，TNF-α与TNF-R1的结合将触发NF-кB（the nuclear factor KB）激活，导致肌肉环指蛋白1（muscle ring finger protein-1，MuRF-1）表达增加，随后通过泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome System，UPS）诱导蛋白质降解。

阿霉素给药使TNF-α水平升高，通过循环系统迁移到组织，而运动能够有效降低TNF-α水平。在一项人体实验中，Tsukui等对41名健康女性进行为期5个月的中等强度运动训练（快走或者游泳），发现训练后血清TNF-α水平显著降低；并且运动后血浆中可溶性TNF-R1和TNF-R2水平显著下降。这提示，阿霉素及运动训练均可影响机体中TNF-α和TNFR表达水平，然而目前尚未有研究指出阿霉素及运动训练对骨骼肌TNFR表达的影响。

综合以上研究背景，本研究通过对小鼠进行8周中等强度有氧运动训练后给药阿霉素，探究运动一段时间后骨骼肌产生的有益效应能否抵抗阿霉素诱导的骨骼肌萎缩，及TNF-α/TNF-R1通路是否为运动发挥作用的途径之一，为运动抵抗阿霉素副作用提供理论依据。

1材料与方法

1.1动物分组

36只3月龄雄性C57BL/6小鼠购自广东省动物中心，许可证号为SCXK（粤）2016-0041，于清洁级实验动物房内3只／笼饲养，室内温度（22±2）℃，相对湿度50%，12 h/12 h光暗循环（考虑老鼠昼伏夜出习性及减少运动干预对其作息的影响，照明时间为21：30到次日9：30）。本实验经华南师范大学伦理委员会审批通过（审查批号：SCNU-SPT-2022-014）。小鼠在实验期间饮食和饮水均不受限制。

适应性喂养1周后，所有小鼠进行适应性运动，共1周。之后将小鼠随机平均分为对照组（SED）和运动组（EXE），每组18只。SED组正常饲养8周，EXE组进行8周中等强度跑台运动训练，结束后对所有小鼠进行运动能力测试。之后从2组中随机选取6只小鼠，在测试48 h后取材。剩余SED组和EXE组小鼠各12只再次分组，SED组小鼠分为生理盐水组（SED-SAL）和阿霉素组（SED-DOX），EXE小鼠分为运动后生理盐水组（EXE-SAL）和运动后阿霉素组（EXE-DOX），每组6只。之后对SED-DOX组和EXE-DOX组进行为期2周的阿霉素给药；对SED-SAL和EXE -SAL注射对应体积生理盐水。给药结束后对各组小鼠进行运动能力测试，48h后取材。

1.2运动干预方案

适应性训练：跑速为10 m/min，运动时间由15min逐天增加到30 min，共进行5d。最后一次适应性运动结束后测试小鼠最大跑速。

正式训练：由于中等强度有氧运动在对比研究中表现出更有效的结果，因而本研究中运动组小鼠以测得平均最大跑速的60%进行训练。单次运动流程为：5 min速度为10m/min的热身运动，之后为50 min正式训练，最后为5min速度为10 m/min的整理活动，均无坡度，每次训练时间固定在19：00—20：30之间，周一至周五训练，共8周。训练期间，每2周进行一次小鼠最大跑速测试，并根据测试结果调整下一次训练的跑速。表1为训练期间EXE组平均最大跑速及训练速度。

1.3阿霉素给药方案

本研究采用分次慢性阿霉素给药方案，更符合临床阿霉素给药方式。给药组小鼠腹腔注射阿霉素，分4次进行，每次剂量为5 mg/kg（体重），4d一次（图1）。此使用剂量根据临床使用剂量换算。阿霉素溶解于生理盐水，浓度为0.5 mg/mL。对照组小鼠根据体重腹腔注射对应体积生理盐水。

1.4样本采集

由于股四头肌是小鼠进行跑台运动时主要使用的肌肉之一，其变化能够反映出运动对骨骼肌带来的影响，故选择股四头肌作为研究组织。

研究表明，较大强度运动结束即刻可能会引起血浆中TNF-α水平升高，在静息一段时间后恢复到基础水平。为避免运动训练及运动能力测试结束即刻小鼠血浆指标的短时变化，均在测试结束48 h后取材。

將小鼠麻醉后记录体重，每只小鼠眼眶采血1mL，然后进行灌注，去除组织中血液。之后完整地取下双侧股四头肌，记录湿重。将左侧股四头肌用EP管收集存放于超低温冰箱，以备后续分子生物学实验；右侧股四头肌固定用于制备冰冻切片。

1.5检测指标与方法

1.5.1H&E染色及肌纤维横截面积统计

使用冰冻切片机将骨骼肌样本切成8μm的切片，固定后进行H&E染色，观察骨骼肌细胞形态。每个样品显微镜下拍照，取图片3张，统一所有样品拍摄位置。使用Image J图像处理软件，统计每个肌纤维横截面积。得到的数据使用Excel软件进行统计分析，计算每个样品肌纤维平均横截面积；统计每个样品不同面积区间肌纤维数量，计算每个区间肌纤维数量占比（区间肌纤维数量／总肌纤维数）。

1.5.2骨骼肌蛋白提取

取股四头肌样品0.1～0.2 g剪碎放入离心管，加入1mL含有1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液和钢珠，使用研磨仪研磨样品，然后在4℃以12600rad/s离心15 min，吸取上清液；使用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，调齐样品浓度为25μg/μL，再加入5×SDS-蛋白上样缓冲液，在100℃沸水中煮8 min，自然冷却至室温后储存在-80℃冰箱备用。

1.5.3 Western Blot

每孔蛋白上样量为25μg。依次进行上样、电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、显影等步骤。最后使用Image J图像处理软件对所得条带进行灰度值测量，计算出目标蛋白的相对表达量。

一抗信息：TNF-α（1：1000，CST，11948S）、TNF-R1（1：500， Santa Cruz， SC-8436）、TNF-R2（1：500， Santa Cruz， SC-8041）、MuRF-1（1：500，Santa Cruz， SC-398608）、Caspase-8（1：1000，CST，85925）、PGC-1α（1：4 000， Proteintech， 66369）、a-Tubulin（1：1000， Beyotime， AF2827）、GAPDH（1：500， Santa Cruz，SC-365062-HRP）。

1.5.4血漿提取及酶联免疫吸附检测（ELISA）

将小鼠血液离心，2600 rad/s，4℃，15 min，吸出上层血浆，放于4℃冰箱备用。

使用江莱生物公司产ELISA试剂盒检测血浆中TNF-α水平。设置标准品孔、空白孔、样品孔（每组取3个样品测试），之后根据说明书添加试剂。终止反应后，将孔板放人酶标仪中，用450 nm波长测量各孔吸光度（OD值），最后根据标准曲线计算样品中TNF-α浓度。

1.5.5肌纤维类型免疫荧光染色及数量统计

使用冰冻切片机将骨骼肌样本切成8μm切片，后将风干的骨骼肌切片，使用M.O.M.封闭液常温封闭1h，一抗24℃过夜孵育（BA-D5（Type Ⅰ），1：100，DSHB; SC-71（TypeⅡA），1：100， DSHB;WGA（with Alexa Fluor 488），1：200， Thermofisher，W11261；用含1% BSA的PBS溶液稀释抗体），第2天拿出片子升至室温，用0.1% PBST（含0.1%Tween的PBS溶液）清洗，之后室温黑暗孵育二抗1h（Alexa Fluor 647 IgM，1：100， Thermofisher; AlexaFluor 594 IgGl，1：100， Thermofisher）。用0.1%PBST清洗后使用封片剂封片，至激光共聚焦显微镜下拍摄。使用扫描模式拍全每个切片，之后用ImageJ图像处理软件统计Ⅰ型、ⅡA型肌纤维数量。

1.6数据处理

本研究所有数据结果均以x+s进行统计分析。采用Graph Pad Prism8.3.0统计软件对实验结果的进行差异分析。其中，SED-SAL与SED-DOX、EXE-SAL与EXE -DOX组数据分别采用t检验分析阿霉素带来的影响，*表示具有显著性差异（P<0.05），**表示具有非常显著性差异（P<0.01）；SED-SAL与EXE-SAL、SED-DOX与EXE-DOX组数据分别采用t检验分析运动带来的影响，#表示具有显著性差异（P<0.05），##表示具有非常显著性差异（P<0.01）；SED与EXE组数据采用t检验分析运动带来的影响，☆表示具有显著性差异（P<0.05），☆☆表示具有非常显著性差异（P<0.01）。

2研究结果

2.1 8周中等强度有氧运动有效抵抗阿霉素导致的小鼠最大跑速下降

阿霉素给药后，SED-DOX组相较SED-SAL组小鼠最大跑速显著下降（P<0.05）。而8周跑台训练后，EXE-SAL组最大跑速显著高于SED-SAL组（P<0.05），且最大跑速的提升在小鼠接受阿霉素给药后在SED-DOX和EXE-DOX组间仍然非常显著（P<0.01，见图2）。这表明8周中等强度有氧运动能有效维持小鼠最大跑速，抵抗阿霉素导致的骨骼肌功能下降。

2.2 8周中等强度有氧运动缓解阿霉素导致的骨骼肌不良反应

阿霉素给药期间，SED-SAL和EXE-SAL组小鼠体重稳定，而SAL-DOX和EXE-DOX组小鼠体重均快速下降（见图3A）。阿霉素给药结束，SED-DOX组相较于SED-SAL组体重非常显著下降（P<0.01），EXE-DOX组相较于EXE -SAL组体重非常显著下降（P<0.01），表明阿霉素给药导致小鼠体重下降：同时，SED-DOX组相较于EXE-DOX组体重同样非常显著性下降（P<0.01，见图3B），表明前期8周中等强度有氧运动能一定程度上缓解阿霉素导致的体重下降。

阿霉素给药后小鼠股四头肌质量受到影响，其中SED-DOX与SED-SAL组相比，股四头肌质量非常显著性下降（P<0.01），而EXE-DOX与EXE-SAL组相比，仅有下降趋势（P=0.111 2）。SED-SAL与EXE-SAL组之间肌肉质量未产生显著性差异，说明前期8周跑台运动并未影响小鼠股四头肌质量；但SED-DOX与EXE-DOX组相比，具有显著性差异（P<0.05，见图3C），说明前期8周中等强度有氧运动能一定程度上抵抗阿霉素导致的股四头肌质量下降。

骨骼肌H&E染色显示，SED-SAL与EXE-SAL组小鼠肌纤维排列整齐致密，肌纤维大小正常：而阿霉素给药处理的SED-DOX与EXE-DOX组小鼠肌纤维间隙增大，部分细胞坏死、破裂，细胞间隙中存在堆积的细胞核（见图3D黄色方框），表明阿霉素给药导致骨骼肌细胞结构受到损伤。

统计小鼠股四头肌平均CSA，具体结果显示，在接受阿霉素给药后平均CSA显著下降，其中SED-DOX与SED-SAL组相比，CSA非常显著性减小（P<0.01）；EXE-DOX与EXE-SAL组相比，CSA显著性减小（P<0.05）；SED-DOX与EXE-DOX组相比，CSA同样也是显著性减小（P<0.05，见图3E），说明之前8周中等强度有氧运动的干预能在一定程度上抵抗由阿霉素导致的股四头肌平均肌纤维CSA减小。

统计不同大小CSA肌纤维的分布数量情况，同样也能反映阿霉素及运动对骨骼肌细胞结构层面的影響。SED-DOX与SED-SAL组及EXE-DOX与EXE-SAL组分别相比，波峰均明显向左迁移，表明阿霉素给药后横截面积小的肌纤维数量增多。EXE-SAL与SED-SAL组相比，波峰显著向右迁移，说明8周中等强度有氧运动使横截面积大的肌纤维数量增多；EXE-DOX与SED-DOX组相比，波峰也向右迁移（见图3F），说明8周中等强度有氧运动能一定程度抵抗阿霉素给药导致的横截面积小的肌纤维数量增多，维持住大肌纤维数量的占比。

通过免疫荧光染色肌纤维类型，探究8周中等强度有氧运动及阿霉素给药对小鼠肌纤维类型的影响。有研究指出骨骼肌肌纤维总数受遗传因素决定，运动干预并不会使肌纤维总数量发生改变。因此，我们对小鼠股四头肌进行肌纤维类型染色，并统计有氧代谢Ⅰ型、ⅡA型肌纤维数量进行比较。结果显示，EXE-SAL与SED-SAL组相比，股四头肌中Ⅰ型肌纤维数量非常显著增加（P<0.01）；SED-DOX与SED-SAL组及EXE-DOX与EXE-SAL组分别相比，股四头肌中Ⅰ型肌纤维数量均非常显著性下降（P<0.01）；而EXE-DOX与SED-DOX组相比无显著性差异（P=0.9530，见图3H）。这说明阿霉素给药导致股四头肌中Ⅰ型肌纤维急剧减少，并且运动对Ⅰ型纤维的保护并不显著。统计ⅡA型肌纤维数量，仅SED-DOX相较于SED-SAL组ⅡA型肌纤维数量显著减少（P<0.05，见图31），表明阿霉素给药同样会造成ⅡA型肌纤维减少，且运动对其保护作用并不显著。

2.3 8周中等强度有氧运动缓解阿霉素导致的

TNF-α水平升高并显著下调股四头肌TNF-R1水平

ELISA检测显示，SED-SAL组血浆中TNF-α水平非常显著低于SED-DOX组（P<0.01），EXE-SAL组相较于EXE-DOX组也具有非常显著的差异（P<0.01），表明阿霉素给药会导致小鼠血浆中TNF-α水平显著升高。同时，EXE-DOX组小鼠血浆中TNF-α水平显著低于SED-DOX组（P<0.05，见图4A），说明8周中等强度有氧运动能缓解由于阿霉素给药导致的血浆TNF-α水平升高。

WB检测股四头肌中TNF-α水平，发现阿霉素给药后SED-DOX组股四头肌中TNF-α水平相较于SED-SAL组显著上升（P<0.05），而EXE -DOX组相较于EXE -SAL组虽然有上升趋势，但并无显著性差异（P=0.1138），并且EXE-DOX组股四头肌TNF-α水平显著低于SED-DOX组（P<0.05，见图4C），说明8周中等强度有氧运动能缓解由于阿霉素给药导致的股四头肌TNF-α水平升高。

WB检测股四头肌中TNF-R1表达水平，结果显示SED-SAL与EXE-SAL组间、SED -DOX与EXE-DOX组间，均具有非常显著性差异（P<0.01），说明8周中等强度有氧运动能显著降低股四头肌TNF-R1的表达。而对比SED-SAL与SED-DOX组，2组间股四头肌TNF-R1水平也存在非常显著性差异（P<0.01），说明阿霉素给药会促进股四头肌TNF-R1的表达；同时，EXE-SAL与EXE-DOX组TNF-R1相对表达量几乎一致（P=0.7539，见图4D），说明8周中等强度有氧运动同时能显著抑制阿霉素导致的股四头肌TNF-R1水平升高。

WB检测股四头肌TNF-R2表达水平，各组间均无显著差异，说明运动及阿霉素对股四头肌TNF-R2水平影响并不显著（见图4E）。

2.4 8周中等强度有氧运动减缓阿霉素诱导的

TNF-α/TNF-R1通路下游反应

WB结果显示，8周中等强度有氧运动及阿霉素对小鼠股四头肌中MuRF-1、Caspase-8的影响是一致的。SED-SAL组股四头肌中2种蛋白水平均显著低于SED-DOX组（P<0.05），说明阿霉素给药导致MuRF-1、Caspase-8表达增加；而EXE-DOX组股四头肌中2种蛋白水平均显著低于SED-DOX组（P<0.05，见图5B、C），说明8周中等强度有氧运动能减缓阿霉素给药导致的股四头肌中肌萎缩相关蛋白MuRF-1及凋亡相关蛋白Caspase-8的表达升高。MuRF-1与Caspase-8各组间变化趋势同TNF-α变化趋势一致，表明他们的变化可能是由于TNF-α/TNF-R1通路激活导致的下游反应。

2.5 8周中等强度有氧运动降低小鼠股四头肌TNF-α及TNF-R1水平

为进一步确认运动对于小鼠股四头肌TNF-α及TNF-R1水平的影响，使用运动后48 h取材小鼠检测。ELISA结果显示，最后一次运动结束48 h后，小鼠血浆中TNF-α水平SED与EXE组组间并无显著差异（见图6A）；但WB结果显示，EXE组股四头肌中TNF-α表达水平显著低于SED组（P<0.05，见图6C）。血浆与股四头肌中TNF-α水平的差异可能是由于运动后股四头肌中PGC-1α激活导致的结果，有研究发现PGC-1α激活能抑制炎症反应，从而降低组织中TNF-α水平。WB结果显示，EXE组股四头肌中PGC-1α表达水平显著高于SED组（P<0.05，见图6D）；将小鼠股四头肌中PGC-1α与TNF-α做相关性分析，发现EXE组具有高PGC-1α和低TNF-α水平分布倾向，而SED组具有低PGC-1α和略高TNF-α水平分布倾向（见图6E）。这说明PGC-1α的表达伴随着TNF-α水平的抑制，但此相关性分析并不能阐明两者间的因果关系。

WB结果显示，训练结束48 h后，EXE组小鼠股四头肌中TNF-R1表达水平已非常显著低于SED组（P<0.01，见图6F），说明确实是8周跑台运动使股四头肌TNF-R1水平显著下降。

3分析与讨论

3.1阿霉素给药导致骨骼肌萎缩

阿霉素是广泛使用的化疗药物，为治疗实体瘤、血液肿瘤、白血病等提供了有效的方法。但阿霉素具有非特异性，健康细胞也会受到影响，因此包括骨骼肌萎缩在内的有害副作用限制了阿霉素全身给药时更有效剂量的临床使用。据估计，多达80%的癌症患者在接受化疗时体重减轻，而骨骼肌过度消耗被认为是导致体重变化的主要原因。本研究中，采用阿霉素分次给药方案：每次5 mg/kg体重，每次间隔4d，共4次，腹腔注射，此方法更符合临床给药剂量及给药方式。结果显示，接受阿霉素给药的小鼠（SED-DOX和EXE-DOX）相比于接受生理盐水的小鼠（SED-SAL和EXE- SAL）体重下降13.5%，股四头肌质量下降9.5%。对比采用相同给药方案的研究，阿霉素给药使小鼠体重下降16%，比目鱼肌质量下降7%，研究结果相似。

本研究對肌肉切片进行H&E染色观察到阿霉素给药后小鼠股四头肌肌纤维排列紊乱，细胞间隙增大，部分细胞出现细胞核外溢以及胶原纤维分布的现象：对肌纤维横截面积的统计结果显示，阿霉素给药导致骨骼肌平均CSA显著减小，且使横截面积小的肌纤维的相对丰度增大，以上结果表明阿霉素给药使小鼠骨骼肌发生萎缩。此结果与聚焦于阿霉素对小鼠胫骨前肌、大鼠比目鱼肌和趾长伸肌影响的相关研究结果一致；在Min等人的研究中进一步指出，阿霉素给药导致小鼠Ⅰ、ⅡA与ⅡB型肌纤维CSA均显著性减小。

在骨骼肌功能方面，本研究仅测试了小鼠的最大跑速，结果显示阿霉素组最大跑速与对照组相比显著下降，表明骨骼肌功能受到阿霉素的影响。多项动物研究发现，阿霉素给药对骨骼肌功能的影响表现在耐力及力量2个方面，不仅使小鼠在最大耐力跑步测试中表现显著受损，且使最大抽搐力呈剂量依赖性降低，同时“力-频率”关系显著降低，多方面表明肌肉功能受损。

3.2 8周中等强度有氧运动抵抗阿霉素导致的骨骼肌萎缩

目前对消除或缓解阿霉素这类药物引起的毒副作用的最佳方法尚未达成共识，而在使用阿霉素治疗的同时，辅助治疗应考虑减轻阿霉素对肌肉的不良影响，以诱导更好的抗肿瘤反应。1979年，Combs等通过一次30 min的剧烈游泳提高了接受阿霉素给药小鼠的存活率，第一次证明运动训练可抵抗阿霉素毒性。这一发现改变了之前人们普遍认为运动训练会因活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生增加和线粒体功能障碍而加剧阿霉素毒性的看法，促进大量工作致力于确定运动如何减少阿霉素毒副作用，并促进多项评估运动作为化疗辅助疗法的安全性和有效性的临床试验开展。

大量研究采用运动作为干预手段以抵抗阿霉素给药产生的副作用，而无论是给药前、给药过程中，或者从给药开始持续至给药结束后一段时间，运动干预都能对骨骼肌产生一定程度的有益影响。不同的运动方式，如有氧运动、抗阻训练、间歇训练，也都能产生有益作用，其中有氧运动在对比研究中表现出更有效的结果。值得一提的是，上述研究中大多数运动方案仅1-2周就能产生有益结果，但他们多采用阿霉素急性给药方式，并在给药72 h内取材，未考虑阿霉素长期作用的影响。

不同运动方式给骨骼肌带来的影响不尽相同，本研究拟探究长期有氧运动对骨骼肌产生的影响，及其是否对阿霉素慢性诱导的骨骼肌萎缩具有保护作用。因而选用中等强度有氧运动预干预方式，使运动组小鼠以60%最大跑步速度进行跑台运动，每次50 min，每周5d，持续8周。结果发现，8周中等强度有氧运动并未影响小鼠的体重、骨骼肌质量、CSA等；而8周中等强度有氧运动使股四头肌中横截面积大的肌纤维丰度增大，并增加有氧代谢Ⅰ型肌纤维数量；在阿霉素给药后，8周中等强度有氧运动能一定程度抵抗阿霉素诱导的小鼠体重下降、运动能力下降，维持住小鼠的肌肉质量、平均CSA等。

3.3抑制TNF-α及TNF-R1水平可能是8周中等强度有氧运动抵抗阿霉素导致的骨骼肌萎缩的途径之一

尽管已经确定在阿霉素给药前进行有氧8运动训练可以缓解阿霉素引起的骨骼肌萎缩，但其中的机制仍不明晰。现有研究发现的有氧运动引起骨骼肌的多种变化，均可能是其中的潜在机制。大量研究表明，阿霉素给药后线粒体功能障碍引起氧化应激，产生大量ROS是损伤骨骼肌的主要途径之一；而运动引起的内源性抗氧化剂增加、线粒体生物活性改善有可能防止阿霉素引起的肌肉萎缩。本研究中小鼠在接受有氧运动训练后，股四头肌中PGC-1α表达增加，不仅仅能抑制组织中TNF-α水平，同时能使线粒体功能增强，这正与大多数研究指出的阿霉素诱导骨骼肌毒性部分是由于ROS的生成增加以及由此导致的肌纤维氧化损伤相对应。除此之外，在蛋白质合成方面，阿霉素给药期间及之后进行有氧运动可通过改善蛋白质合成信号通路mTOR/P70S6等来抵抗阿霉素诱导的小鼠骨骼肌萎缩；在蛋白质降解方面，有氧运动能够通过多种途径抑制阿霉素导致的蛋白质水解系统UPS的激活。

除上述可能机制外，Gilliam等人发现TNF-α诱导的膈肌无力是通过TNF-R1介导的。另一项研究向小鼠植入可溶性TNF-R1，发现TNF-α可能是导致荷瘤小鼠骨骼肌中蛋白质丢失的原因；另一方面，他们又通过敲除TNF-R1减轻了荷瘤小鼠骨骼肌中蛋白质丢失。以上结果表明，TNF-R1水平是TNF-α/TNF-R1通路诱导骨骼肌萎缩的关键因素。本研究发现，阿霉素诱导小鼠血浆、股四头肌中TNF-α水平显著升高，且TNF-α与TNF-R1结合后，激活下游反应的相关蛋白MuRF-1和Caspase-8表达水平显著升高，因而TNF-α/TNF-R1通路可能是本研究中阿霉素诱导骨骼肌萎缩的途径之一。检测运动后小鼠血浆及股四头肌TNF-α水平发现，8周中等强度有氧运动能显著降低股四头肌中TNF-α表达水平：更为重要的是.8周中等强度有氧运动能非常显著抑制股四头肌中TNF-R1水平，并且在阿霉素给药后，对TNF-R1表达的抑制仍能维持，表明8周有氧运动能够有效下调TNF-R1表达水平，抑制细胞凋亡和蛋白质降解反应，维持骨骼肌质量和肌纤维大小，缓解阿霉素造成的骨骼肌萎缩。

关于运动对TNF-R1的影响，在现有发表过的研究中，仅Tsukui等的研究显示为期5个月中等强度规律运动能抑制肥胖女性循环血液中TNF-α、可溶性TNF-R1和TNF-R2蛋白表达水平。Stracz-kowski等的研究结果显示持续12 d的70%最大心率的功率自行车训练对循环中可溶性TNF-R1水平并无影响，此研究结果与Tsukui等研究的不同可能是由于运动干预仅进行了12d，在干预时长上未达到抑制TNF-R1表达的程度。这2项研究关注运动对循环血液中可溶性TNFR表达水平的影响，而本研究突破性地发现8周中等强度有氧运动能显著抑制小鼠股四头肌中TNF-R1表达水平。但需要说明的是，本研究并未进一步验证运动前后、阿霉素给药前后TNF-α与TNF-R1的结合水平：同时并未指出TNF-R1水平的下调在持续运动的第几周能出现显著性的变化，此变化在停止运动训练后能维持多长时间。

4结论

8周中等强度有氧运动抑制股四头肌TNF-α、TNF-R1表达水平，抑制阿霉素给药后TNF-α/TNF-R1通路下游蛋白质降解和细胞凋亡反应，这可能是运动抵抗阿霉素诱导小鼠股四头肌萎缩的潜在原因之一。

作者贡献声明：

陈梦洁：设计并进行实验，收集、处理数据，撰写、修改论文。

段锐：构建实验框架，提供实验指导，修改论文。