翻译调控在纤维化发生中的作用进展

陈 伟,彭金梅 ,聂开瑜

(1.遵义医科大学附属医院 烧伤整形外科,遵义医科大学组织损伤修复与再生医学省部共建协同创新中心,贵州 遵义 563003;2．铜仁市人民医院 烧伤整形外科,贵州 铜仁 554300)

纤维化可以发生在几乎全身所有器官,其临床治疗的研究进展也相对缓慢,导致我们目前没有一个很好的方案来解决这类疾病。蛋白质的合成是一个以mRNA为模板进行翻译的过程,这对生命的延续具有重要意义,也是很多疾病发生发展的动力来源[1-3]。在蛋白质形成具有特定功能蛋白质的过程中,除了基因的表达之外,翻译控制对蛋白质的形成也是至关重要的[4-5]。翻译控制包括了对翻译过程速度的调节、起始时间节点的调节[6]以及翻译终止等方面。近年来,在纤维化疾病的分子机制研究中,翻译控制对纤维化疾病的影响受到越来越多的研究者重视。

1 纤维化疾病的流行病学

纤维化疾病涉及广泛,累及皮肤、脏器以及关节等多种组织;严重威胁着全球的健康。仅发达国家,约有45%的死亡原因与纤维化有关[7]。据世界卫生组织统计报告,2019年全球十大致死疾病排行榜中,就有5类疾病与纤维化明显相关,包括缺血性心脏病、慢性阻塞性肺疾病、呼吸道感染、肺癌和肾脏疾病。此外,2019年华盛顿大学全球疾病负担研究报告中,指出我国十大主要致死疾病中,就有八类纤维化相关疾病[8],涉及心血管、呼吸、消化以及运动等多个系统。近年来,纤维化被证明与多种癌症的发生有关系[9],这也是纤维化疾病高致死率的原因之一。以酒精性肝硬化为例,该疾病的发生率呈逐年上升,死亡率已上升至4.5/10万[10]。

2 纤维化疾病的病理基础

纤维化发生的病因包括创伤、感染、代谢及自身免疫等多个方面[11]。病理主要表现为器官或组织的纤维结缔组织增多,实质细胞的减少[12]。导致器官及组织的功能损害,严重者危及生命。目前认为,纤维化的形成包括了炎症介质及血小板产生和聚集期、炎症因子迁移期、成纤维细胞增殖期及纤维化形成期4个时期。研究较为热门的信号通路有分泌蛋白Wnt家族、转化生长因子以及Yes相关蛋白等。纤维化涉及多种细胞的参与,例如成纤维细胞[13]、表皮干细胞[14]、血管内皮细胞[15]、雪旺细胞[16]、免疫细胞[17]以及脂肪细胞等。以成纤维细胞为主,多种细胞以增殖、迁移或分化等方式相互作用导致纤维化的形成。在分子研究中,经典的转化生长因子β1通路在各个器官中对纤维化的影响已得到证实[18-21],转化生长因子β通过Smad依赖或非依赖Smad等途径,激活成纤维化细胞并影响其表型介导纤维化的形成[22]。并且转化生长因子β可作为多个促纤维化因子的交汇途径,在纤维化的发生、发展中起着至关重要的作用。此外,通过Hippo[23]、Wnt[24]、p38 MAPK[25]、PPAR-γ信号通路[26]调控纤维化形成的研究,推动了对纤维化认识。这些基础研究的发展,为临床治疗纤维化疾病提供了理论支持。

3 翻译水平调控纤维化发生的机制

纤维化的特征之一表现为细胞外基质的沉积或比例的失衡[27],纤维化的形成与纤维化相关蛋白质的分泌有关,靶向调控纤维化相关蛋白分泌的通路可能获得有效的治疗方案。根据遗传学中心法则[28],分子水平中涉及的调控机制可能与复制、转录、逆转录或翻译水平有关。翻译过程作为产生蛋白质的关键环节,对纤维化形成起着至关重要的作用。翻译的过程又受到很多因子的调控;例如翻译起始因子家族[29-30]、延伸因子、释放因子、丝/苏氨酸激酶等。近年来,在翻译水平探索纤维化的分子机制研究也越来越多。

3.1 翻译起始因子在纤维化相关蛋白形成过程中的调控 翻译的起始是一个复杂的过程,包括起始复合体,起始因子以及能量的参与[31]。翻译起始的调控主要涉及起始因子、阻遏蛋白、核糖体循环[32]等。这些调控方式存在于几乎所有的翻译起始水平,纤维化相关蛋白的产生,也离不开这些调控因素。

在翻译起始因子家族中,比如翻译起始因子6,Scagliola等[33]的研究观察到,翻译起始因子6的表达量能够明显的影响机体的代谢水平,在肝脏纤维化疾病的进展中起着重要的作用,翻译起始因子6在肝脏中的表达降低明显的减少了转录因子C/EBPβ的翻译,从而减缓了肝脏纤维化疾病的进展。

Zhang等[34]在细胞衰老及器官纤维化研究中观察到,控制cGAS-STING-PERK-翻译起始因子2α信号通路中任一因子,作用于具有细胞膜依赖性的mRNA,能够在蛋白质的翻译水平控制器官纤维化的形成,并且通过翻译起始因子2α S51位点的显著磷酸化抑制帽依赖型的mRNA翻译过程,这一通路目前在小鼠实验中得到验证。作为非经典的cGAS-STING信号通路,通过翻译起始因子2α的磷酸化最终影响蛋白质的合成,在翻译的起始阶段调控纤维化的形成。 Shu等[35]在肾脏纤维化中观察到,内质网的应激与自噬行为与肾小管的纤维化进展密切相关,可能通过PERK / 翻译起始因子2α途径激活内质网应激调控纤维化蛋白的生成和凋亡。在心脏和肾脏纤维化中也观察到内质网应激的影响[36-37],是否同时有翻译水平的调控,需要进一步实验的证实。在肺部纤维化中,内质网的应激所导致的纤维化中明显检测到翻译起始因子2α蛋白的表达增加[38]。Ito等[39]在肺部纤维化疾病中,通过药物作用于翻译起始因子2α的磷酸化过程,调节了肺部纤维化的形成。一项非酒精性脂肪肝的研究中,研究者提出一氧化碳能够通过线粒体的一系列的反应,依赖翻译起始因子2α所参与的PERK-翻译起始因子2α-ATF4信号传导途径,最终改善脂肪肝向肝纤维化的转变[40]。 Li等[41]在肥胖诱导的非酒精性脂肪肝研究中观察到,翻译起始因子2α在疾病的进展中起着关键的作用。Ríos-Ocampo 等[42]在丙型病毒性肝炎研究中发现,翻译起始因子2α的磷酸化通过翻译起始因子2α/ATF4介导的信号通路,调节丙型病毒性肝炎核心蛋白的降解过程,在肝脏纤维化致病过程发挥作用。由于上皮-间充质转化为组织修复提供了更多细胞来源, Duan等[43]在细胞上皮-间充质转化研究中,肯定了翻译起始因子2α在SMAD信号通路的作用,翻译起始因子2α的磷酸化与否调节着Smad信号通路。 Xiong等[44]在心肌纤维化中观察翻译起始因子2α的蛋白表达增加。

翻译起始因子3也是重要翻译调控因子之一,是翻译起始因子家族中最庞大、最复杂的起始因子家族[45]。有研究观察到翻译起始因子3在肺和肾脏的纤维化中起到重要作用[46]。翻译起始因子3中最大的亚基,翻译起始因子3a可以在转化生长因子β1的介导下影响α平滑肌肌动蛋白以及胶原蛋白的合成,调节纤维化的形成。 Li等[47]研究发现,翻译起始因子3a在疤痕疙瘩通过下调翻译起始因子3a的表达,抑制转化生长因子β1通路导致的瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞外基质蛋白的表达。Gao等[48]通过小鼠肺纤维化模型证实,抑制翻译起始因子3a介导的信号通路,能够抑制上皮-间充质转化过程,有效防治小鼠肺部纤维化的形成。在大多数组织中阴离子通道维持着细胞内部的水合作用平衡,比如氯离子通道的异常使得组织失去了水合作用,局部组织发生非炎症性损伤导致纤维化的形成。Hutt等[49]通过模型模拟囊性纤维化疾病发现,翻译起始因子3a基因突变在囊性纤维化发生中,通过影响阴离子通道调节因子的折叠过程而影响纤维化相关信号通路的激活。

Hashimoto等[50]在胰腺癌的研究中观察到,小GTP酶介导的通路能够引起胰腺病变组织的纤维化发生。翻译起始因子4A受小GTP酶的mRNA水平调控,而翻译起始因子4E调控着癌基因MYC的mRNA水平。 Fu等[51]通过雷帕霉素,Smad2和翻译起始因子-4E的mRNA表达的浓度依赖性降低,转化生长因子β1的表达降低抑制体外培养的尿道来源成纤维细胞的胶原的合成能力。Sun等[52]在缺氧条件下观察翻译起始因子4E2-GSK3β途径,翻译起始因子4E2为缺氧时被激活的翻译起始因子,能够与RNA发生特异性的结合来抑制癌基因p53的翻译。阻断该途径可以导致肝脏的纤维化。

翻译起始因子5A是原核生物重要的起始因子,是一种高度保守的蛋白质,主要调节富含脯氨酸多肽链的形成。而胶原蛋白就是富含脯氨酸的蛋白质,胶原蛋白质是细胞外基质中最主要的蛋白质,细胞外基质的沉积是纤维化形成的重要病理基础。当翻译起始因子5A耗尽时,会明显影响细胞核周围I型胶原的合成。Barba-Aliaga 等[53]通过翻译起始因子5A抑制剂能够抑制人肝星状细胞中胶原蛋白的合成。Giraud等[54]在对肾脏移植的研究中发现,使用翻译起始因子5A抑制剂处理后的供体,能够在术后减轻供体移植反应所带来的肾脏纤维化。

3.2 翻译延伸阶段对纤维化相关蛋白合成的调控 肽链延伸是翻译的关键步骤,是许多延伸因子协同完成的动态过程[55]。在真核细胞中,延伸因子主要包括延伸因子1α、延伸因子1β和延伸因子2等[56]。延伸因子的本质是蛋白质,它们的有序作用,控制着进位、成肽和移位等翻译过程。

Shwachman-Diamond综合征(shwachman-diamond syndrome,SDS)是一种常染色体隐性遗传病[57-58],因其致病机制是核糖体成熟因子基因突变[59],导致核糖体复合物GTP酶1无法激活,无法促进核糖体大亚基的胞质成熟,又名核糖体病[60]。Tan等[61]在一项病例报告中,提到1例14岁女性类似SDS综合征的患者, 核糖体成熟因子基因纯合突变,导致患者几乎包含了SDS的所有临床表现;不同的是患者出生时就有肝纤维化病理表现,肝纤维化随着年龄的增加而减轻。SDS患者由于核糖体成熟因子基因突变,延伸因子1无法去除起始因子6,导致核糖体亚基无法成熟而产生发育迟缓的表型。Wilson等[62]在对非酒精性脂肪肝研究中,使用延伸因子1α1的抑制剂阻碍了脂肪的生成。随后研究观察到,延伸因子1α1能抑制肝脏星状细胞的增殖和胶原蛋白的合成,最终促进肝纤维的形成。

延伸因子2是真核细胞延伸因子中的一类,延伸因子2激酶是钙调蛋白激酶家族的一员,是蛋白质合成的负调控因子[63]。目前观察到延伸因子2激酶作用的唯一底物是延伸因子2,能够影响延伸因子2的磷酸化过程[64]。 Wang等[65]研究观察到,延伸因子2激酶通过P38-MAPK信号通路,影响着成纤维细胞的增殖与分化,影响肺部纤维化的进展。

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3.3 翻译终止过程对纤维化相关蛋白合成的调控 翻译的终止意味着一条新生的多肽链的合成[66]。终止包括两个方面,一是新生多肽链的释放,二是核糖体的解离。参与新生多肽链合成终止的调节因子叫做释放因子,释放因子目前分为Ⅰ类和Ⅱ类[67],核糖体的解离也受核糖体解离因子的调控[68]。这些因子的调控,使得机体能够快速且精准的合成蛋白质。

正确的识别终止密码子是翻译正常蛋白质的关键之一[69]。层蛋白A和C是由LMNA编码的[70],在细胞核的支撑结构起到关键作用。LMNA-R225X是LMNA的终止密码子的一种突变类型,这个位点的突变,会导致层蛋白的翻译异常而引发心脏疾病,典型的疾病代表就有扩张型心肌病核房室传导阻滞。病理基础为房室结部位的纤维化。 Cai等[71]通过研究发现,LMNA突变在翻译过程发生改变导致异常蛋白质的产生,诱发心机细胞的凋亡而促进细胞外基质的沉积导致心脏纤维化的发生。

终止子的识别需要多种蛋白质的协调作用来完成[72],囊性纤维化就是终止子识别异常所致[73]。通过在正常终止密码子前插入一个终止密码子,称之为过早终止子[74-75],导致翻译过程中无义翻译介导的mRNA水平降低、蛋白质的短缺,最终影响阴离子通道形成异常而影响的细胞正常功能。研究观察到,乙烯响应因子1减少介导了无义翻译的发生[76]。Lee等[77]在探索囊性纤维化疾病的治疗方案过程中发现,真核释放因子3通过促进识别终止密码子,提前终止阴离子通道变异调控的翻译,减轻囊性纤维化疾病患者肺部纤维化的程度。并且发现乙烯响应因子3a的降解剂还可以抑制细胞膜上钠离子通道功能。

肝星状细胞能够在许多病理情况下发生变化[78],是肝纤维化中的重要参与细胞。Xu等[79]观察到,乙烯响应因子3b-37通过下调细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白依赖性激酶4的mRNA表达和上调P21的水平,导致G0/G1细胞周期阻滞和抑制DNA合成;通过抑制α平滑肌肌动蛋白的mRNA水平来调节细胞的迁移;并且通过对转化生长因子β1信号通路的抑制来改变肝纤维化。

3.4 纤维化相关蛋白的合成在翻译水平其他调控因素 在翻译水平还存在很多调节因素,在近年的研究中越来越受到人们的关注,可能涉及翻译起始、延伸以或终止等过程。例如非编码的小RNA,包括微小RNA、转运RNA以及小核糖体RNA等,非编码的小RNA通过不同的修饰产生不同的生物学效应[80]。

微小RNA是一种内源性的非编码RNA,通过与靶mRNAs的3′非编码区特异性结合,在起始或启动后阻断翻译,它能够特异性的结合某些mRNA使其降解,其功能的发挥也依赖于与沉默复合体的结合[81]。近年来,微小RNA在肝纤维化治疗中取得了进展[82-85]。Piccolo等[83]通过小鼠实验观察到,miR-34b/c在JNK和FOXO3的刺激下能够表达增加,作用于下游效应分子血小板源性生长因子的mRNA,使得血小板源性生长因子分泌减少,减少肝脏纤维化的发生。另有研究观察到由于微小RNA靶向的mRNA不同,可以表现为上调或者下调[86]。在肝脏中下调的微小RNA,例如miR-129-5p,它能与I型胶原蛋白的非编码区结合,从而降低肝形状细胞中的胶原蛋白的表达[87]。Li等[88]通过临床研究观察到,miR-200a能够以锌指蛋白3为靶点,在肝脏的纤维化形成过程中调控纤维化,包括对α平滑肌肌动蛋白和白蛋白表达水平的调控。 Gao等[89]在小鼠肝脏纤维化模型中也观察到,miR-690能够靶向NAD激酶的mRNA导致其降低,从而抑制肝脏纤维化的形成。Tang等[90]通过小鼠实验观察到,miR-542-3p在肾脏中能够与AGO1的3′非编码区特异性结合,而影响蛋白的翻译调控肾脏纤维化的发生。Mahtal等[91-92]通过细胞培养和小鼠实验观察到微小RNA在肾脏纤维化的作用。微小RNA在其他脏器的纤维化形成中的作用,包括心脏、肠道、胆道系统以及肺[93-97]等部位。

转运RNA是翻译mRNA密码子和合成蛋白质分子的关键分子。研究者在动物体内观察到了反密码子转运RNA对早终止密码子的修复功能[75]。用于识别反密码子转运RNA,通过调节过早终止密码子减少无效蛋白的翻译,在先天性遗传性疾病囊性纤维化的治疗中应获得了可观的疗效[98]。线粒体转运RNA基因的突变与许多疾病相关, Daniil等[99]在临床患者外周血观察到,通过对线粒体转运RNA突变点位鉴定出新的4个致病点位,这四个突变在特发性肺纤维化和结节病患者中常见。

脯氨酸转运RNA是蛋白质合成的重要参与者,抑制脯氨酸-转运RNA的形成可以抑制蛋白质的合成,脯氨酸转运RNA合成酶是催化脯氨酸转运RNA形成的关键酶[103]。有研究显示氟呋喃酮能够抑制谷氨酰脯氨酰转运RNA合成酶介导的纤维化[104]。Song等[105]通过小鼠实验观察到,谷氨酰脯氨酸转运RNA合成酶 1介导的纤维化是通过转录和翻译水平调控的,在翻译水平中谷氨酰脯氨酰转运RNA合成酶 1通过与Janus激酶、信号转导器和转录激活因子组成的蛋白质-蛋白质复合物调控纤维化的形成。该研究团队在之前的研究中,还发现了特发性肺纤维中谷氨酰脯氨酰转运RNA合成酶 1类似的作用机制[106]。近年来,基于脯氨酸转运RNA合成酶的抑制剂也在抗纤维化治疗中获得进展[107]。

氨酰基转运RNA合成酶能够将对应的氨基酸与转运RNA结合起来,在蛋白质的正确合成中起着至关重要的作用[108]。氨酰基转运RNA合成酶最主要是通过催化氨基酸的酰化来控制蛋白质和的高保真性,同时其还有一些非酶活性催化功能,能特异性的结合某些结构域,被结合的结构域形成新的氨酰基转运RNA合成酶复合物后获得相应的功能,包括免疫反应、mTORC1信号通路[109]、纤维化和血管生成信号通路等[110]。

Piwi蛋白相作用RNA是近年来发现的一类小非编码RNA,最初发现与生殖细胞相关[111],随后人们发现了它与肿瘤的形成有关[112],近来观察到其与肝脏纤维化发生密切相关。Tang等[113]通过小鼠实验观察到,Piwi蛋白相作用RNA可以通过翻译起始因子3B途径,促进肝星状细胞的增殖、α平滑肌肌动蛋白和I型胶原蛋白合成而影响肝脏纤维化。

环状RNA是有别于其他非编码RNA的一类,从结构上它呈环状,没有5′帽和3′尾,从功能上它以竞争性内源性机制发挥作用。Yang等[114]综述了近年来环状RNA在纤维化疾病的研究进展,包括对巨噬细胞、转化生长因子β的激活等,环状RNA大多是通过与微小RNA相互作用而促进纤维化,环状RNA能够在多个脏器以不同的靶标对纤维化产生调控。以心脏纤维化为例,环状蛋白激酶3在心脏中能够降低miR-17-3p水平,从而增加腺苷环化酶6的水平,最终诱导肾上腺素的产生而导致心肌纤维化的发生[115]。 Jia等[116]通过细胞培养在研究PM 2.5所致肺部纤维化中观察到,circ-406961与白介素增强因子2相互作用后,能够激活转录激活因子3和丝裂原活化蛋白激酶8的磷酸化,抑制PM 2.5所致的肺纤维化发生。

长非编码RNA在许多疾病的进展中都起着作用。Bridges等[117-119]通过细胞培养在对疤痕疙瘩的研究中观察到,依赖于翻译起始因子3A参与的途径长非编码RNA H19能够促进疤痕疙瘩的形成,翻译起始因子家族在翻译水平对纤维化相关蛋白生成的调控在前文已经阐述。Jiang等[120-121]在临床患者组织样本的研究观察到,通过S1PR2/SphK2 和 let-7/HMGA2轴,长非编码RNA含量与胆道淤积所致的肝纤维化成正相关。 Chen等[122-123]在肾脏纤维化中发现,长非编码RNA可以通过miR-145/翻译起始因子5A2通路影响细胞的活化、增殖以及迁移导致纤维化的发生。Ghafouri-Fard等[124]也综述了目前长非编码RNA在器官纤维化和衰老相关的研究进展。

4 展望

我们通过总结发现,纤维化疾病的发生、发展在翻译水平的调控是复杂多样的,受到起始因子、延长因子、释放因子及非编码小RNA等的调控。翻译水平的单一因素可能调控了纤维化疾病的发生,但更多的是多因素协同作用所致,多因素的综合作用决定了翻译的结局。因此无法通过对某一因素的控制而获得最佳治疗效果,这跟临床目前提倡的综合治疗纤维化类疾病相吻合。

在翻译起始、延伸及终止水平都有对纤维化相关蛋白的形成产生调控。核糖体循环是产生ATP的枢纽,对翻译过程的能量支持起着关键作用,增加探索核糖体循环对纤维化的研究可能会有新的突破。基因突变导致翻译终止异常而产生纤维化,可利用基因编辑小鼠构建对应的疾病模型,获得更准确的体内实验结果分析具体的分子机制。非编码小RNA在多种脏器中靶向目的基因获得了抗纤维化的疗效,但缺乏是否可实现临床转化的验证。除此之外,翻译后修饰对纤维化相关蛋白生成的影响也逐渐增多,包括磷酸化、甲基化及泛素化等。我们似乎找到了一些新的研究方向,但传统的热门领域也待更深研究。提示了在纤维化疾病的分子机制研究中,我们还有漫长的基础研究需要去探索。