基于高通量测序分析中草药对发酵泡菜亚硝酸盐含量的影响及机制

燕平梅 张聪聪 贾晶晶 赵虎威

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.05.010

引文格式：燕平梅，张聪聪，贾晶晶，等.基于高通量测序分析中草药对发酵泡菜亚硝酸盐含量的影响及机制[J].中国调味品，2024，49（5）：59-64.

YAN P M， ZHANG C C， JIA J J， et al.Analysis of effect and mechanism of Chinese herbal medicine on nitrite content in fermented pickles based on high-throughput sequencing[J].China Condiment，2024，49（5）：59-64.

摘要：為了探究金银花、黄柏两种中草药对发酵泡菜亚硝盐含量的影响及机制，基于高通量测序技术分析泡菜微生物群落结构，采用分光光度法分析泡菜中亚硝盐含量。研究结果表明，分别添加5%金银花和5%黄柏的泡菜中亚硝酸盐含量（8.02，5.90 mg/kg）均显著低于对照组（12.87 mg/kg）（P<0.05）。对泡菜样品进行高通量测序，共得到202个可操作分类单元（OTU），分属于11个门、129个属、165个种。添加5%的金银花和5%黄柏发酵10 d 的泡菜样品中微生物的Chao 1指数显著低于对照组（P<0.05）。Proteobacteria（变形菌门）是各个样品中的优势菌门，相对含量高达90%。不同中草药处理的微生物在属水平上的优势微生物相对含量相差很大，对照组、添加金银花的发酵泡菜组、添加黄柏的发酵泡菜组中 Pseudomonas（假单胞菌属）的相对含量分别为52%、1%、1%；Serratia（沙雷氏菌属）的相对含量分别为15%、0%、1%；Achromobacter（无色杆菌属）的相对含量分别为7%、1%、0%。实验结果表明金银花和黄柏对发酵白菜中亚硝酸盐形成的抑制作用是由于其抑制了肠杆菌科（Serratia、Achromobacter）和 Pseudomonas（假单胞菌属）微生物的生长繁殖。

关键词：高通量测序；发酵泡菜；中草药；亚硝酸盐；微生物多样性

中图分类号：TS255.54      文献标志码：A      文章编号：1000-9973（2024）05-0059-06

Analysis of Effect and Mechanism of Chinese Herbal Medicine on Nitrite

Content in Fermented Pickles Based on High-Throughput Sequencing

YAN Ping-mei， ZHANG Cong-cong， JIA Jing-jing， ZHAO Hu-wei

（Taiyuan Normal University， Taiyuan 030619， China）

Abstract： In order to explore the effect and mechanism of two Chinese herbal medicines， namely honeysuckle and phellodendron， on nitrite content in fermented pickles， the microbial community structure of pickles is analyzed based on high-throughput sequencing technology， and spectrophotometry is used to analyze the nitrite content in pickles. The results show that the nitrite content of pickles added with 5% honeysuckle and 5% phellodendron （8.02， 5.90 mg/kg） is significantly lower than that of the control group （12.87 mg/kg） （P<0.05）. Through high-throughput sequencing of pickle samples， a total of 202 operational taxonomic units （OTU） are obtained， belonging to 11 phyla， 129 genera and 165 species. The Chao 1 index of microorganism in pickle samples added with 5% honeysuckle and 5% phellodendron fermented for 10 d is significantly lower than that of the control group （P<0.05）. Proteobacteria is the dominant phylum in each sample， with the relative content of 90%. The relative content of dominant microorganisms in genus level of microorganisms treated with different Chinese herbal medicines is quite different. The relative content of Pseudomonas in the control group， the pickle sample group added with honeysuckle and the pickle sample group added with phellodendron is  52%， 1% 1% respectively. The relative content of Serratia is 15%， 0%， 1% respectively. The relative content of Achromobacter is 7%， 1%， 0% respectively. The experimental results show that the inhibitory effect of honeysuckle and phellodendron on the formation of nitrite in fermented Chinese  cabbage is due

收稿日期：2023-12-27

基金项目：国家自然基金委员会面上项目（40871131，31171743）;山西省自然基金面上项目（202303021211119）

作者簡介：燕平梅（1968—），女，教授，博士，研究方向：微生物生态学。

to their inhibition on the growth and reproduction of microorganisms of Enterobacteriaceae （Serratia， Achromobacter） and Pseudomonas.

Key words： high-throughput sequencing; fermented pickles; Chinese herbal medicine; nitrite; microbial diversity

发酵作为一种生物过程现被广泛用于食物生产和保存[1]。传统的泡菜利用蔬菜附着的微生物进行发酵[2]，泡菜的制作成本低廉、口感丰富；泡菜有助于提高食欲，促进消化，深受消费者的喜爱[3]，是发酵企业的主要产品。泡菜通过参与发酵的乳酸菌来恢复肠道菌群的平衡，通过各种可能的机制降低胆固醇水平，如同化、酶解或与其他胆盐共沉淀[4]。

随着科技的进步和人们认识的提高，传统发酵食品越来越受到人们的青睐，未来的发酵食品更朝向功能化发展，传统发酵食品的市场必将更加广阔，最近几年，应用于食品发酵的技术已经从手工生产发展到工业生产，以生产出高质量的标准发酵产品。此外，人们对发酵过程的生化背景知识缺乏，导致许多传统发酵食品存在安全性问题。亚硝酸盐是一种常见的食品添加剂，用来固定颜色、提高质地、抑制梭状芽孢杆菌的生长。亚硝酸盐能引起高铁血红蛋白症，变成亚硝胺的重要前体物质，由叔胺和仲胺的反应产生，存在于日常生活经常摄入的各种食物中[5-6]。无论是人工添加的还是天然存在于食品中的亚硝酸盐，都是潜在的致癌物，控制它们的浓度对维持食品的安全性至关重要。金银花享有“国宝一枝花”的美誉，是常见的中药之一，具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆的功能[7-8]。黄柏也是一种具有良好抗菌效果的中药材，味道较苦，偏寒性。前人研究表明，黄柏在抗炎、抗病毒、消除细菌、维持血压等方面有显著效果[9]。本实验在泡菜中分别加入中草药（金银花和黄柏）研究其对泡菜中亚硝酸盐含量和群落结构的影响。

近年来，新一代高通量测序技术的出现为研究发酵蔬菜微生物群落结构提供了新方法[10]。然而，泡菜发酵过程中微生物群落的演替变化以及微生物群落与亚硝酸盐形成和降解的关系并不明确。本文应用高通量测序技术研究添加不同中草药的发酵泡菜中细菌群落结构构成，揭示细菌群落的多样性，探讨添加不同中草药的发酵泡菜中细菌群落和亚硝酸盐浓度变化之间的关系，为深入研究泡菜发酵过程中微生物的功能作用奠定了基础。进一步了解传统发酵食品的微生物生化背景，明确传统发酵食品的营养价值和功能性，运用现代科技手段保证其安全性，为人们提供既营养美味又安全可靠的发酵食品。

1  材料和方法

1.1  实验材料

新鲜白菜、金银花、黄柏、食用盐、DNA提取试剂盒。

1.2  实验仪器

琼脂糖凝胶电泳仪  美国Bio-Rad公司；WFJ2100型可见分光光度计  尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.3  实验方法

1.3.1  发酵泡菜的制作和取样

将新鲜白菜清洗干净，放置在洁净工作台上用紫外线照射数分钟，切碎成适宜大小后放入经高温灭菌的锥形瓶中，每瓶30 g，加入90 mL 4%的盐水，每3个为一组，分别加入5%金银花和5%黄柏，只加盐水的为对照组，将所有泡菜放置在室温（16～20 ℃）下发酵。

发酵泡菜10 d，在经紫外线灭菌过的洁净工作台上用镊子取出一定量的发酵泡菜研磨后进行亚硝酸盐含量的测定，再取出一定量的发酵液，用于pH检测和DNA提取。

1.3.2  亚硝酸盐含量和pH测定

发酵泡菜中亚硝酸盐的测定采用盐酸萘乙二胺法，用分光光度计测量溶液在550 nm处的吸光度值，绘制标准曲线。使用pH211型数显pH计，待pH计呈现的数字稳定后再进行记录。

1.3.3  DNA提取和高通量测序

实验样品的DNA提取按照DNA提取试剂盒给定的步骤进行。将提取的DNA样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.3.4  数据分析

按照相似度97%对非重复序列进行操作分类单元（operational taxonomic units，OUT）聚类，最后采用RDP Classifier贝叶斯算法对97%相似度的OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平上统计每个样品的群落组成。利用Mothur软件构建稀释性曲线，利用 QIIME 软件计算样品的Chao 1丰富度指数、Shannon多样性指数、Simpson指数等。利用Excel软件绘制群落分布饼图。利用R语言制作热图，主坐标分析图。

2  结果与分析

2.1  添加中草药的发酵泡菜中亚硝酸盐含量和pH值

添加中草药的发酵泡菜中亚硝酸盐含量见表1。添加5%金银花和5%黄柏的发酵泡菜发酵10 d时样品中亚酸盐含量显著低于对照组（P<0.05）；在相同发酵时间内，添加5%金银花的泡菜中亚硝酸盐含量与添加5%黄柏的泡菜中亚硝酸盐含量无显著差异。

添加中草药的发酵泡菜的pH值见表2。泡菜发酵10 d时，加入5%金银花和5%黄柏的泡菜发酵液的pH值显著低于对照组（P<0.05），在相同发酵时间内，添加5%金银花的泡菜的pH与添加5%黄柏的泡菜的pH无显著差异。

2.2  不同中草药处理的发酵泡菜中微生物稀释曲线

本次对7个样品进行高通量测序，共得到332 824条序列，平均序列长度为427.11 bp。OUT数为202个，包括11个门、129个属、165个种。不同中草药处理的发酵泡菜中微生物稀释曲线见图1，稀释曲线可以根据测序数据量来反映物种的丰富度，说明测序数据量是否合理，测序深度是否可靠地表现出微生物组成[11]。

由图1可知，稀释曲线逐渐趋于平缓，测序数据达到饱和，能够覆盖本次测序中绝大部分物种，说明本次测序深度能够反映出样品中的细菌含量。

2.3  微生物群落生态指数

Chao 1和Shannon指数是衡量群落中物种总数和多样性的常用指数[12-13]。Chao 1值越大表明群落中物种的丰富度越高；而Shannon指数可以反映样品的多样性程度，Shannon值越大表明样品群落多样性越高。本次研究通过样品测序序列计算各样品中多样性指数，见表3。添加5%黄柏的发酵泡菜发酵10 d时样品中微生物的Shannon指数显著低于添加金银花的样品和对照组（P<0.05）；添加5%金银花的泡菜中微生物的Shannon指数与对照组无显著差异（P＞0.05）。添加5%黄柏的发酵泡菜发酵10 d时样品中微生物的辛普森指数（Simpson index）显著高于添加金银花和对照组（P<0.05）；添加5%金银花的泡菜中微生物的辛普森指数（Simpson index）与对照组无显著差异（P＞0.05）。添加5%金银花和5%黄柏的发酵泡菜发酵10 d时样品中微生物的Chao 1指数显著低于对照组（P<0.05）；添加5%金银花的泡菜中微生物的Chao 1指数与添加5%黄柏的泡菜无显著差异（P＞0.05）。

2.4  不同中草药处理的微生物相对含量

不同中草药处理的微生物在门水平上的相对含量见图2，在各个样品中 Proteobacteria（变形菌门）为优势菌门，相对含量高达90%。在不添加中草药的对照组中，微生物主要包括8个门，其中Proteobacteria（变形菌门）的相对含量为92.95%，Actinobacteria（放线菌门）的相对含量为2.9%，Bacteroidetes（拟杆菌门）的相对含量为2.9%，Firmicutes（厚壁菌门）的相对含量为1.19%，Verrucomicrobia（疣微菌门）的相对含量为0.02%，unclassified_k_norank_d_Bacteria的相对含量為0.01%，Acidobacteria（醋杆菌门）的相对含量为0.001%；Planctomycetes（浮霉菌门）的相对含量为0.001%；添加金银花的发酵泡菜中，微生物主要包括8个门，其中Proteobacteria（变形菌门）的相对含量为97.66%，Actinobacteria（放线菌门）的相对含量为1.89%，Bacteroidetes（拟杆菌门）的相对含量为0.01%，Firmicutes（厚壁菌门）的相对含量为0.44%，Verrucomicrobia（疣微菌门）的相对含量为0.007%，Chloroflexi（绿弯菌门）的相对含量为0.003%，Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）的相对含量为0.003%，Planctomycetes（浮霉菌门）的相对含量为0.001%，添加黄柏的发酵蔬菜中，微生物主要包括7个门，其中Proteobacteria（变形菌门）的相对含量为99.38%，Actinobacteria（放线菌门）的相对含量为0.11%，Bacteroidetes（拟杆菌门）的相对含量为0.01%，Firmicutes（厚壁菌门）的相对含量为0.49%，Chloroflexi（绿弯菌门）的相对含量为0.001%，Acidobacteria（醋杆菌门）的相对含量为0.002%，Tenericutes（软壁菌门）的相对含量为0.003%。不同中草药处理的发酵泡菜的优势菌门均为Proteobacteria（变形菌门），Firmicutes（厚壁菌门）的相对含量较少。

不同中草药处理的微生物在属水平上的优势微生物的相对含量见图3～图5。

由图3～图5可知，在属水平上，不同中草药处理的发酵泡菜中细菌多样性差异较大。 Stenotrophomonas（寡养食单胞菌属）、Psychrobacter（嗜冷杆菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Serratia（沙雷氏菌属）、Acinetobacter（不动杆菌属）、Achromobacter（无色杆菌属）、Lelliottia（河生肠杆菌）为优势属。不同处理的泡菜中优势菌的相对含量相差很大，对照组、添加金银花的发酵泡菜、添加黄柏的发酵泡菜中Stenotrophomonas（寡养食单胞菌属）的相对含量分别为15%、25%、58%；Psychrobacter（嗜冷杆菌属）的相对含量分别为3%、51%、19%；Pseudomonas（假单胞菌属）的相对含量分别为52%、1%、1%；Serratia（沙雷氏菌属）的相对含量分别为15%、0%、1%；Acinetobacter（不动杆菌属）的相对含量分别为4%、3%、3%；Achromobacter（无色杆菌属）的相对含量分别为7%、0%、1%；Lelliottia（河生肠杆菌）的相对含量分别为5%、1%、3%。另外，对照组中检出Raoultella（劳特菌属）4%；添加金银花的发酵泡菜中检出Marinomonas（海单胞菌属）5%;添加黄柏的发酵泡菜组中检出Sphingomonas（鞘氨醇单胞菌）4%、Ochrobactrum（苍白杆菌属）5%。

2.5  不同中草药处理微生物热图

不同中草药处理的微生物多样性热图见图6，热图的不同颜色代表不同的丰度，图中一个色块代表一个样品中一个属的丰度，纵向是样品的聚类情况，反映不同样品在属水平上群落组成的相似性，颜色差异反映群落组成的差异性。HB-2所含微生物属最少，优势菌群为假单胞菌属，其他样品均含有Weissella（魏斯氏菌属），Leuconostoc（明串珠菌属）是引起发酵的主要菌属，且在含金银花的样品中颜色较深，丰度较大。在不添加中草药的对照组（CK）中所含物种最丰富，细菌多样性最高。添加中草药后，微生物之间竞争更加激烈，一些在泡菜体系中适应能力较其他微生物弱的微生物被淘汰，适应性强的微生物在后期发挥主要作用，这可能是添加中草药的发酵泡菜中细菌多样性较少的原因。

3  讨论

添加不同中草药成分对泡菜中亚硝酸盐含量有很大影响，刘芳等[14]研究黄芪、党参、当归这3种中草药的复合水煎液对泡菜中亚硝酸盐含量的影响，结果表明，不同浓度的中草药水煎液对亚硝酸盐都有比较明显的削减效果。本实验研究了加入5%金银花和5%黄柏对发酵泡菜中亚硝酸盐含量的影响，结果表明，在相同发酵时间内，添加不同浓度的金银花和黄柏的泡菜中亚硝酸盐含量都显著低于对照组，表明金银花和黄柏对泡菜中亚硝酸盐含量有明显的削减作用，此结果与刘芳等的研究结果一致。

高通量测序分析不同中草药处理的微生物在属水平上的优势微生物的相对含量相差很大，对照组、添加金银花的发酵泡菜组、添加黄柏的发酵泡菜组中 Pseudomonas（假单胞菌属）的相对含量分别为52%、1%、1%；Serratia（沙雷氏菌属）的相对含量分别为15%、0%、1%；Achromobacter（无色杆菌属）的相对含量分别为7%、0%、1%。Serratia（沙雷氏菌属）和Achromobacter（无色杆菌属）属于肠杆菌科。肠杆菌科和 Pseudomonas（假单胞菌属）是蔬菜发酵初期促使亚硝酸盐形成的主要微生物[15]。添加金银花和黄柏的发酵泡菜中Pseudomonas（假单胞菌属）的相对含量（1%、1%）明显低于对照组（52%）；肠杆菌科（Serratia，0%、1%）和Achromobacter（0%、1%）的相对含量明显低于对照组（15%、7%），表明金银花和黄柏对发酵泡菜中亚硝酸盐形成的抑制作用是由于其抑制了促使亚硝酸盐形成的肠杆菌科和Pseudomonas（假单胞菌属）微生物的生长繁殖。

通过高通量测序技术对添加不同中草药的发酵泡菜中细菌群落结构特征进行分析，结果表明添加5%金银花和5%黄柏的发酵泡菜发酵10 d时样品中微生物的 Chao 1指数显著低于对照组（P<0.05）。造成此结果的原因可能是金银花和黄柏对多种致病菌均有一定的抑制作用。研究表明，金银花中的绿原酸和黄酮类物质含量均较多，对病原菌有较强的抑制作用[16]，研究表明，金银花对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等均有一定的抑制作用[17]，黄柏在抗炎、消除细菌、抗病毒、维持血压等方面能起到特有的效果[18]，对变形杆菌、金黄色葡萄球菌以及甲型和乙型链球菌等均有抑制效果[19-20]，可能是金银花和黄柏中的有效成分抑制了发酵过程中有些细菌的生长，导致细菌的丰富度减少。

通过传统分离培养方法，一些泡菜发酵过程中的关键微生物种类得到解析，包括明串珠菌属（Leuconostoc）、乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、片球菌属（Pediococcus）和魏斯氏菌属（Weissella）等[21-24]。在本次实验中也发现明串珠菌属（Leuconostoc）、魏斯氏菌属（Weissella）的相对含量均很低。与取样时间有关，泡菜实验在室温（16～20 ℃）下发酵10 d取样时处于发酵初期。由于发酵初期除乳酸菌外的大量杂菌繁殖，影响了乳酸菌成为优势菌。

高欣等[25]的研究表明加入大蒜可以降低亚硝酸盐的含量，加入常见的绵白糖[26]、白酒[27]和花椒[28]等均可以降低发酵泡菜的亚硝酸盐含量，在泡菜腌制过程中，适当地加入某一种或多种调味料，不仅可以满足人们对风味的需求，而且能够提高产品的安全性。中国中草药资源丰富，食用历史悠久，未来可结合抗菌中草药的研究，在泡菜中添加天然中草药，提高泡菜的安全性，同时增加泡菜的营养价值。

参考文献：

[1]徐丹萍，蒲彪，刘书亮，等.不同发酵方式的泡菜挥发性成分分析[J].食品科学，2015，36（6）：94-100.

[2]贾晶晶，陈燕飞，程晖，等.黄芩对发酵白菜亚硝酸盐含量影响[J].中国调味品，2020，45（10）：72-74.

[3]陈功.试论中国泡菜历史与发展[J].食品与发酵科技，2010，46（3）：1-5.

[4]CORZO G， GILLILAND S. Bile salt hydrolase activity of three strains of Lactobacillus acidophilus[J].Journal of Dairy Science，1999，82（3）：472-480.

[5]ZENG X Q， PAN Q， GUO Y X， et al. Potential mechanism of nitrite degradation by Lactobacillus fermentum RC4 based on proteomic analysis[J].Journal of Proteomics，2019，194：70-78.

[6]ZHANG C C， CHEN J B， LI X Q， et al. Bacterial community and quality characteristics of the fermented potherb mustard （Brassica juncea var. multiceps） under modified atmospheres[J].Food Research International，2019，116：266-275.

[7]王本祥.現代中药药理学[M].天津：天津科学技术出版社，1997：204-208.

[8]于生兰，张龙，孙玲.金银花的研究进展[J].时珍国医国药，2002，13（8）：498-500.

[9]陈晴，谢鲲鹏，云宝仪，等.黄柏等中草药对MRSA的抑菌作用及其对质粒的消除作用[J].微生物学杂志，2013，33（3）：54-57.

[10]佟婷婷，田丰伟，王刚，等.基于宏基因组分析四川泡菜母水作引子的泡菜发酵过程中细菌多样性变化[J].食品工业科技，2015，36（21）：173-177.

[11]YAN P M， JIA J J， ZHAO H W， et al. Changes and driving mechanism of microbial community structure during Paocai fermentation[J].Fermentation，2022，8（6）：281-296.

[12]KIRBY K.Ecological diversity and its measurement[J].Biometrics，1989，46（2）：81-99.

[13]CHAO A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population[J].Scandinavian Journal of Statistics，1984，11（4）：265-270.

[14]刘芳，陈加，吴婷婷，等.三种配伍中草药复合水煎液对泡菜 腌制过程中微生物菌系的影响研究[J].中国调味品，2016，41（11）：74-77.

[15]燕平梅.发酵蔬菜中亚硝酸盐含量及优良发酵菌种筛选的研究[D].北京：中国农业大学，2007.

[16]范远景，徐晓伟，余芳芳，等.分离纯化金银花绿原酸工艺研究[J].安徽农业科学，2010，38（24）：13052．

[17]宋海英，邱世翠，王志强.金银花的体外抑菌作用[J].时珍国医国药，2003，14（5）：269.

[18]杨周平，武志军.中药黄柏的药理作用和临床应用研究[J].甘肃医药，2010，29（3）：329-331.

[19]陈蕾，邸大琳.黄柏体外抑菌作用研究[J].时珍国医国药，2006，17（5）：759-760.

[20]安健，赵建平.黄柏抗菌成分的提取及对真丝的抗菌性研究[J].印染助剂，2008（6）：13-15.

[21]燕平梅，王炫月，赵文婧.泡菜中亚硝酸盐形成、还原相关微生物的研究[J].中国调味品，2022，45（9）：77-94.

[22]赵虎威，陈燕飞，燕平梅.泡菜发酵中微生物的研究[J].中国调味品，2022，47（1）：211-216.

[23]贾晶晶，魏爱丽，赵虎威，等.基于高通量测序分析不同食盐浓度的酸菜中微生物多样性[J].中国调味品，2022，47（8）：167-174.

[24]金紅星，杨希寅，成文玉.辣白菜中分离含内源性质粒的魏斯氏菌及其鉴定[J].中国酿造，2012，31（1）：77-79.

[25]高欣，燕平梅，白小军，等.不同大蒜浓度对发酵白菜品质的影响[J].中国调味品，2009，34（8）：64-67.

[26]高洁荣，燕平梅.绵白糖对发酵白菜亚硝酸盐含量的影响[J].中国酿造，2009（2）：89-91.

[27]王静，燕平梅，张志虹，等.不同白酒浓度对发酵白菜中亚硝酸盐浓度的影响[J].中国调味品，2008，33（12）：49-52.

[28]王立霞.花椒对3种泡菜自然发酵过程中亚硝酸盐含量的影响研究[J].包装与食品机械，2016，34（4）：10-14.