清肝润肺止咳露高效液相色谱特征图谱、含量测定及化学模式识别的研究

黄樱华，熊颖，骆月姬，梁振生（.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 50405；.广州市药品检验所，广东 广州 5060）

清肝润肺止咳露是广州中医药大学第一附属医院院内制剂，由罂粟壳、人参叶、龙脷叶、枇杷叶、秋梨干等13味药材组成，具有清肝肺之火、润肺止咳的功效，临床上广泛应用于治疗肝火犯肺证的慢性咳嗽患者，且临床疗效显著[1-2]。清肝润肺止咳露主要含有生物碱类、皂苷类、萜类、酚酸类等有效成分，方中罂粟壳为君药，具有敛肺、涩肠、止咳之功效，用于治疗久咳，久泻，脱肛，脘腹疼痛[3]。罂粟壳主要药效成分是生物碱类，包括吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁、蒂巴因等，具有镇痛、镇咳和解痉的作用[4-7]，同时具有一定的毒性和成瘾性[8-10]。罂粟壳是我国唯一列入麻醉药品管理的中药饮片[11]，临床亦可见不良反应事件[12-13]。清肝润肺止咳露现行质量标准仅有薄层色谱鉴别，无法全面有效地控制其质量。中药色谱指纹图谱结合化学计量学方法可以较为全面准确地评价中药及其制剂的质量，是中药研究和开发的有效工具和方法[14-15]。本研究建立清肝润肺止咳露高效液相色谱（HPLC）特征图谱，测定吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁4个生物碱成分的含量，结合化学模式识别法，以全面有效地评价清肝润肺止咳露的质量。

1 仪器与试药

HP1260高效液相色谱仪、二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；对照品吗啡（批号：171201-201825，含量93.9%）、磷酸可待因（批号：171203-201306，含量97.5%，简称可待因）、蒂巴因（批号：171216-201304，含量100%）、盐酸罂粟碱（批号：171214-201205，含量99.5%，以下简称罂粟碱）、那可丁（批号：171224-201304，含量99.9%），中国药品生物制品检定研究院；10批清肝润肺止咳露，广州中医药大学第一附属医院制剂中心，编号：S1～S10；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC特征图谱的建立

2.1.1色谱条件 色谱柱：ZOBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为甲醇（A）-5μmoL·L-1庚烷硫酸钠溶液（用磷酸调节pH至2.6，B），梯度洗脱（0～2 min，15%A；2～35 min，15%A→40%A；35～80 min，40%A）；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：20℃；进样量：10μL。

2.1.2混合对照品溶液的制备 精密称取对照品吗啡3.55 mg、可待因3.40 mg、蒂巴因0.42 mg、罂粟碱2.90 mg、那可丁1.84 mg，置于10 mL量瓶中，加20%甲醇（含5%乙酸）溶解并定容，制成混合对照品溶液。

2.1.3供试品及缺罂粟壳阴性样品溶液的制备 精密量取清肝润肺止咳露10 mL，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10 mL。合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10 mL棕色量瓶中。加甲醇至刻度，摇匀，即得。同法制备缺罂粟壳阴性样品溶液。

2.1.4精密度试验 取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S2）1份，按“2.1.1”项下条件连续进样6次，记录色谱图。以峰9（吗啡）为参照峰，计算得共有峰相对保留时间的RSD＜1.52%，相对峰面积的RSD＜3.55%，表明该方法精密度较好。

2.1.5重复性试验 取清肝润肺止咳露（编号S2），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1.1”项下条件进样测定，记录色谱图。以峰9（吗啡）为参照峰，计算得共有峰相对保留时间的RSD＜2.15%，相对峰面积的RSD＜3.32%，表明该方法重复性较好。

2.1.6稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S2）1份，按“2.1.1”项下条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图。以峰9（吗啡）为参照峰，计算得共有峰相对保留时间的RSD＜1.87%，相对峰面积的RSD＜3.46%，表明供试品在24 h内较稳定。

2.1.7特征图谱的建立 取10批清肝润肺止咳露，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下条件进样，将色谱图分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012版）》，以S1为参照图谱，生成10批样品（S1～S10）的HPLC叠加指纹图谱（见图1）和清肝润肺止咳露的对照特征图谱（见图2），并确定16个共有峰。

图1 10批清肝润肺止咳露的高效液相色谱特征图谱叠加图Figure 1 HPLC superimposed fingerprint of 10 batches of Qinggan Runfei Zhike Distillate

图2 清肝润肺止咳露的对照特征图谱Figure 2 Reference HPLC reference fingerprint of Qinggan Runfei Zhike Distillate

2.1.8共有峰的指认 将清肝润肺止咳露样品与混合对照品图谱进行比对，指认峰9为吗啡、峰11为可待因、峰14为蒂巴因、峰15为罂粟碱、峰16为那可丁，保留时间分别为25.854、32.036、43.503、50.068、62.788 min，且清肝润肺止咳露（缺罂粟壳）阴性样品未见上述5个指认峰（见图3）。结果显示吗啡（峰9）是罂粟壳的主要成分，峰面积适中，分离度较理想，故选择吗啡为参照峰。

注：9.吗啡；11.可待因；14.蒂巴因；15.罂粟碱；16.那可丁图3 混合对照品（A）、清肝润肺止咳露（B）及缺罂粟壳阴性样品（C）的高效液相色谱图Figure 3 HPLC fingerprint of mixed reference substance（A），samples（B）and negative sample lacking Papaveris pericarpium（C）of Qinggan Runfei Zhike Distillate

2.1.9相似度评价 应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》分析10批清肝润肺止咳露特征图谱的相似度。结果显示，与对照特征图谱比较，清肝润肺止咳露（S1～S10）的相似度为0.999、0.998、0.999、0.998、0.981、0.998、0.998、0.998、0.981、0.998，表明10批样品相似度较高。

2.2 清肝润肺止咳露的含量测定

2.2.1色谱条件 同“2.1.1”项下。

2.2.2对照品溶液的制备 精密称取对照品吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁适量，分别置于5mL量瓶中，加20%甲醇（含5%乙酸）溶解并定容，分别制成质量浓度分别为348、345、302、192μg·mL-1的对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备 同“2.1.3”项下。

2.2.4线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液2、5、10、15、20、25μL，在上述色谱条件下进样测定。以进样量（μg）对峰面积Y进行线性回归，得回归方程和相关系数。结果见表1。

表1 清肝润肺止咳露中4种成分的标准曲线Table 1 Standard curves of the four components in Qinggan Runfei Zhike Distillate

2.2.5精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁峰面积的RSD分别为1.18%、0.83%、1.21%、1.43%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.6稳定性试验 取清肝润肺止咳露（编号S2），按“2.2.3”项下制备，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁峰面积的RSD分别为2.05%、2.18%、2.49%、2.38%（n=6），表明清肝润肺止咳露供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.2.7重复性试验 精密量取清肝润肺止咳露（编号S2）10mL，共6份，按“2.2.3”及“2.2.1”项下制备并进样测定，记录峰面积，计算样品各成分的含量。结果吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁的平均含量分别为49.63、44.31、31.71、20.95μg·mL-1；RSD分别为2.54%、1.35%、2.38%、2.52%（n=6），表明方法重复性良好。

2.2.8加样回收试验 精密量取已知含量的清肝润肺止咳露（编号S2）6份，每份5 m L，分别精密加入吗啡对照品溶液（254μg·m L-1）、可待因对照品溶液（201μg·mL-1）、罂粟碱对照品溶液（161μg·mL-1）、那可丁对照品溶液（101μg·mL-1）及20%甲醇（含5%乙酸）各1 mL，按“2.2.3”及“2.2.1”项下制备与进样测定，计算加样回收率。结果显示，吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁的平均加样回收率为97.93%～99.43%，RSD为2.55%～3.09%（n=6），表明该方法准确度良好。结果见表2。

表2 清肝润肺止咳露中4种成分加样回收率结果（n=6）Tab 2 Results of sample recovery rates for four components in Qinggan Runfei Zhike Distillate（n=6）

2.2.9样品测定 结果见表3。取10批清肝润肺止咳露，按“2.2.3”及“2.2.1”项下制备并进样测定，计算样品含量。

表3 10批清肝润肺止咳露含量测定结果（μg·mL-1，n=2）Table 3 Content determination results of 10 batches of Qinggan Runfei Zhike Distillate（μg·mL-1，n=2）

2.3 化学模式识别分析

2.3.1聚类分析（CA） 以10批清肝润肺止咳露HPLC特征图谱的16个共有峰的峰面积为变量，平方欧式距离为测度，应用SPSS 26.0软件进行聚类分析。结果显示，10批清肝润肺止咳露可聚为两类，S3、S4、S8、S10聚为一类，其余聚为一类。说明10批样品质量存在一定的差异，可能与投料饮片的差异有关。见图4。

图4 10批清肝润肺止咳露的聚类分析树状图Figure 4 Hierarchical clustering analysis for 10 batches of Qinggan Runfei Zhike Distillate

2.3.2主成分分析（PCA） 对10批次清肝润肺止咳露HPLC特征图谱的16个共有峰峰面积进行标准化处理，采用SIMCA 14.0软件进行PCA。结果显示，S3、S4、S8、S10位于得分图的右侧，其余样品位于得分图的左侧，与上述聚类分析结果基本一致。结果见图5。

图5 10批清肝润肺止咳露的PCA得分图Figure 5 The PCA scores plots for 10 batches of Qinggan Runfei Zhike Distillate

2.3.3偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA） 对10批次的清肝润肺止咳露HPLC特征图谱的16个共有峰峰面积进行标准化处理，采用SIMCA 14.0软件进行PLS-DA。由PLS-DA得分图（见图6）可见，在95%置信区间内，10批样品聚成2类，其中S3、S4、S8、S10位于得分图的左侧，其余位于右侧，与CA及PCA结果基本一致。在PLS-DA载荷图中，数据点越偏离原点，表示其对应变量权重越大[16]。由图7可见，16个共有峰中峰2、峰8、峰4、峰13的权重较大。为进一步寻找样品中差异性较大的成分，使用变量投影重要性（VIP）评价方法对10样品共有峰进行分析。VIP值越大，表明该变量对其整体模型的贡献越大，VIP值大于1，说明该变量对整体模型的贡献度高于平均水平，可作为筛选具有显著贡献变量的标准[16]。运用SIMCA 14.0软件计算清肝润肺止咳露样品16个共有峰的VIP值。结果有9个共有峰的VIP值＞1，依次为峰2、峰4、峰13、峰11（吗啡）、峰1、峰10、峰8、峰12、峰16（那可丁）。见图8。

图6 10批清肝润肺止咳露的PLS-DA得分图Figure 6 The PLS-DA scores plots for 10 batches of Qinggan Runfei Zhike Distillate

图7 10批清肝润肺止咳露中16个共有峰的PLS-DA载荷图Figure 7 The PLS-DA loading plot of 16 common peaks for 10 batches of Qinggan Runfei Zhike Distillate

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法本研究比较了乙酸乙酯萃取法和正丁醇萃取法制备清肝润肺止咳露供试品溶液，结果发现，以正丁醇萃取法制得的样品杂峰较少，有利于共有峰及待测成分色谱峰的分析与辨认，且清肝润肺止咳露中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁、蒂巴因5个成分能够完全分离，所得的色谱峰峰形好。

3.2 色谱条件的筛选比较了ZORBAX SB-AQ、ZORBAX Eclipse XDB-C18、ZORBAX Extend C183种不同类型的色谱柱，结果发现ZORBAX SB-AQ色谱柱所得色谱峰峰形对称、分离效果理想、基线平稳，因此选择ZORBAX SB-AQ色谱柱。对乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-5μmoL·L-1庚烷硫酸钠溶液（磷酸调节PH至2.6）流动相梯度洗脱体系[17-21]进行了比较，结果显示，前3种流动相体系基线不稳定，色谱峰分离效果差且峰数量少，因此选择甲醇-5μmoL·L-1庚烷硫酸钠溶液（磷酸调节pH至2.6）进行梯度洗脱。比较不同检测波长（210、220、250、270 nm）下的色谱图，当检测波长为220 nm时，所得色谱峰数量较多，分离度较好，故选择检测波长为220 nm。

3.3 特征图谱及含量测定结果分析特征图谱结果显示，10批清肝润肺止咳露样品的特征图谱有16个共有峰，与对照指纹图谱的相似度均大于0.98；与混合对照品图谱进行比对，指认了峰9为吗啡，峰11为可待因，峰14为蒂巴因，峰15为罂粟碱，峰16为那可丁。由于蒂巴因峰面积较小，方法学试验各项数据RSD均大于3%，因此不列入含量测定的目标成分。含量结果显示，10批清肝润肺止咳露中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁的含量分别为43.58～76.47、16.64～78.92、29.93～41.22、14.44～32.22μg·mL-1，吗啡含量较高的批次（S4、S10），可待因、罂粟碱、那可丁的含量也较高。目前，部分含罂粟壳的中成药仅建立了吗啡的含量限度，但若患者使用了吗啡含量较高的含罂粟壳的中成药，则该药的可待因、罂粟碱、那可丁含量也较高，是否会增加成瘾性或不良反应值得进一步研究。建议收集更多批次的清肝润肺止咳露样品，确定吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁的限度范围，以保证用药安全。

3.4 化学模式识别分析CA、PCA、PLS-DA结果显示，10批清肝润肺止咳露可聚为2类，S3、S4、S8、S10为一类，其余为一类。表明不同批次的清肝润肺止咳露的质量有差异。9个共有峰VIP值＞1，依次为峰2、峰4、峰13、峰11（吗啡）、峰1、峰10、峰8、峰12、峰16，其中峰11、峰16均来自罂粟壳，提示罂粟壳可能是造成清肝润肺止咳露质量差异的因素之一。

综上所述，本研究所建立的HPLC特征图谱和含量测定方法操作简便、准确，结合化学模式识别法可用于清肝润肺止咳露的质量控制，VIP值大于1的有9个共有峰可能为影响清肝润肺止咳露质量的差异性成分。