迷迭香粗提物提取工艺优化及其抑菌活性

王思雨，张国玉，张永祥，运立媛，3*，张民，3，4*

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300392；2.新疆冠农股份有限公司，新疆库尔勒 841000；3.农业农村部智慧养殖重点实验室（部省共建）；4.天津农学院农产品加工中俄联合研究中心，天津 300392）

迷迭香（RosmarinusofficinalisL.），别名海洋之露，是唇形科多年生芳香常绿灌木，是一种具有悠久栽培历史和食用历史的天然香料植物，同时也是最早使用的医药用植物之一，原产地为环地中海沿岸地区，在我国已成功引种并得到广泛推广[1-2]。迷迭香富含黄酮、挥发油、多酚、萜类等多种生物活性化合物，具有抗微生物、抗氧化、抗炎、免疫调节等功效，尤其是迷迭香中的迷迭香酸、鼠尾草酸等具有较强的抗菌和抗氧化活性[3]。因此，迷迭香粗提物作为天然抗氧化剂因其安全性高、抗氧化能力强等特点日益受到重视。然而，对于迷迭香粗提物的抑菌活性和防腐效果的研究报道较少。

随着人们生活水平的提高，食品安全问题越来越被重视，而在贮藏、运输等过程中由于微生物、温度、食品结构等因素影响，食品保鲜受到诸多挑战[4]。目前，添加食品防腐剂仍是防止食品腐败变质的主要手段之一，但某些常用化学合成防腐剂存在致畸性、致癌性和引起食物中毒等问题，因而使用天然防腐剂被认为是提高微生物安全性的有效替代方案[5-6]。

因此，本研究利用单因素结合响应面法对迷迭香提取工艺进行优化，利用牛津杯法、滤纸圆片法对迷迭香粗提物的抑菌活性进行初步探讨，以期为开发迷迭香天然防腐剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

迷迭香：市售；无水乙醇（分析纯）：上海风船信息科技有限公司；大肠杆菌（Escherichiacoli）菌种冻干粉、绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）菌种冻干粉、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）菌种冻干粉、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）菌种冻干粉：北京北纳创联生物技术研究院；营养琼脂、LB 培养基、素琼脂：北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-250B-Z 型生化培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；SW-CJ-2D 型双人净化工作台：浙江孚夏医疗科技有限公司；LDZX-30KBS 型立式高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；RE-52A 型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；FD-250101 型冷冻干燥机：杭州富睿捷科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 迷迭香粗提物提取单因素试验设计

将迷迭香磨粉，过60 目筛后得到迷迭香粉，称取5.0 g 迷迭香粉，加入一定体积的乙醇溶液在一定温度下进行回流提取，过滤、合并滤液，再浓缩至干，称量粗提物（即迷迭香粗提物）质量。以此为提取方法，分别考察液料比[4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1（mL/g）]、提取时间（20、40、60、80、100 min）、提取温度（60、70、80、90、100 ℃）、提取次数（1、2、3、4、5 次）、乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）对迷迭香粗提物得率的影响。

1.3.2 迷迭香粗提物得率的计算

迷迭香粗提物得率（Y，%）的计算公式如下。

式中：m为迷迭香粗提物的质量，g；M为迷迭香粉的质量，g。

1.3.3 响应面试验优化迷迭香粗提物试验设计

根据中心组合（Box-Behnken）试验设计原理，结合单因素试验结果，采用五因素三水平的响应面分析法[7]。响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.4 菌悬液制备

将菌种冻干粉活化传代后，进行稀释涂布培养计数。用无菌水10 倍梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66 种菌悬液，涂布培养计数，选择含菌数约1×106CFU/mL 菌悬液进行后续试验[8]。

1.3.5 抑菌圈的测定

1.3.5.1 牛津杯法测定

将牛津杯121 ℃灭菌备用，无菌操作下，将牛津杯放入制好的含菌平板中，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入50 μL 样液，做3 个平行，以无菌水为空白对照组，预扩散后在37 ℃下恒温培养24 h，观察菌落生长状况[9]。

1.3.5.2 滤纸圆片法测定

用打孔器将定性滤纸打成6 mm 小圆片，置于培养皿中，121 ℃灭菌15 min 后备用；无菌操作下，将灭菌滤纸片浸于迷迭香粗提物中充分浸泡，浸泡2 h 后取出。将浸泡好的滤纸片放入制成的含菌平板上，预扩散后在37 ℃下恒温培养24 h，观察菌落生长情况[10]。

1.3.6 最低抑菌浓度测定

采用二倍稀释法，将迷迭香粗提物用40%乙醇水溶液稀释为原液的100.00%、50.00%、25.00%、12.50%、6.25%、3.13% 6 个浓度（即浓度分别为100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13 mg/mL）。准备无菌平板，取100 μL 供试菌悬液于平板上，均匀涂布，分别吸取1 mL不同稀释度的提取液至含菌平板上，每组重复3 次。将培养皿倒置放于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察供试菌生长状况[11]。

1.4 数据处理与分析

采用Origin 2019 作图，Design-Expert V8.0.6 进行响应面分析，SPSS 25 进行统计学分析，P＜0.05 表示具有统计学显著性差异，P＜0.01 表示具有统计学极显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 液料比对迷迭香粗提物得率的影响

液料比对迷迭香粗提物得率的影响见图1。

图1 液料比对迷迭香粗提物得率影响Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of crude extract of rosemary

由图1 可知，迷迭香粗提物得率呈先上升后下降趋势，液料比在6∶1（mL/g）时，迷迭香粗提物得率达到最大值。当液料比超过6∶1（mL/g），增加实际生产成本[12]，因此，选择液料比5∶1、6∶1、7∶1（mL/g）进行后续响应面试验。

2.1.2 提取温度对迷迭香粗提物得率的影响

提取温度对迷迭香粗提物得率的影响见图2。

图2 提取温度对迷迭香粗提物得率影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of crude extract of rosemary

由图2 可知，随着提取温度的升高，迷迭香粗提物得率呈先上升后下降的趋势。提取温度为80 ℃时，得率最高，但随着提取温度的升高，迷迭香粗提物得率出现降低的趋势，这可能由于温度过高，促使迷迭香粗提物分子结构发生变化，加速物质氧化及降解，导致得率降低[13]。因此选择提取温度70、80、90 ℃进行后续响应面试验。

2.1.3 提取时间对迷迭香粗提物得率的影响

提取时间对迷迭香粗提物得率的影响见图3。

图3 提取时间对迷迭香粗提物得率影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of crude extract of rosemary

由图3 可知，随着提取时间的延长，迷迭香粗提物得率呈先升高后下降的趋势，提取时间为60 min 时，迷迭香粗提物得率最高；提取时间超过60 min 后，迷迭香粗提物得率降低。这可能是由于过短时间内迷迭香中活性物质无法全部溶解，而提取时间过长会使迷迭香中活性成分如迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚等发生降解，从而导致得率的降低[14]。因此选择提取时间40、60、80 min 进行后续响应面试验。

2.1.4 乙醇浓度对迷迭香粗提物得率的影响

乙醇浓度对迷迭香粗提物得率的影响见图4。

图4 乙醇浓度对迷迭香粗提物得率影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of crude extract of rosemary

由图4 可知，随着乙醇浓度的增大，得率先增大后减小，这可能是由于乙醇浓度的增加能够增强细胞的穿透力，促进溶剂的渗透，从而提高迷迭香粗提物得率。乙醇浓度为60% 时，迷迭香粗提物得率最高；随着乙醇浓度的增加，迷迭香粗提物得率出现下降趋势，这可能是由于迷迭香粗提物具有广泛极性，当溶液极性过低或过高时，会减少粗提物成分的溶解，导致提取率的降低[15]。因此选择乙醇浓度50%、60%、70%进行后续响应面试验。

2.1.5 提取次数对迷迭香粗提物得率的影响

提取次数对迷迭香粗提物得率的影响见图5。

图5 提取次数对迷迭香粗提物得率影响Fig.5 Effect of extraction times on the yield of the crude extract of rosemary

由图5 可知，随着提取次数的增加，迷迭香粗提物得率逐渐升高，当提取3 次后，迷迭香粗提物得率无显著性差异变化。随着提取次数的增加，得率趋于平缓。产生上述现象的原因是随着提取次数的增加，迷迭香中物质逐渐溶出，但3 次后已完全溶出，故提取次数超过1、2、3 次后，迷迭香粗提物得率的增加不显著，应选取提取次数1、2、3 次进行后续响应面试验[16-17]。

2.2 响应面试验结果

以液料比、浸提时间、提取温度、乙醇浓度、提取次数为考察因素，以迷迭香粗提物得率为响应值，进行响应面优化试验，Box-Behnken 试验设计与结果见表2。

表2 响应面设计方案及结果Table 2 Response surface design scheme and results

通过Design-Expert V8.0.6 软件计算出回归方程，得回归方程为Y=32.99+1.06A-0.55B-1.14C-0.43D+4.5E+0.000AB+0.95AC-1.38AD-1.32AE-2.55BC+1.05BD-0.055BE-0.40CD+1.65CE+1.59DE-3.29A2-3.58B2-4.56C2-4.49D2-1.98E2。该模型的有效性和显著性分析见表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3 可以看出，P＜0.000 1，该回归模型极显著，失拟项＞0.05，失拟项不显著，说明回归模型可以准确描述5 个因子对迷迭香粗提物得率的作用规律，试验误差小，可以利用该模型分析及预测迷迭香粗提物得率。R2值常用来表示拟合度，该模型R2=0.913 8，表明回归模型与实际结果接近。R2Adj=0.844 8，表明可以利用该模型来判断84.48% 响应值的变化情况。精密度12.056，表明试验准确度较高，从回归方差分析可知，方程一次项A、C对迷迭香粗提物得率的作用显著（P＜0.05）、方程一次项E、二次型A2、B2、C2、D2、E2，以及交互项BC对迷迭香粗提物得率的作用极显著（P＜0.01）。

由F值可知，5 个因子对迷迭香粗提物得率的作用程度，各因子作用的主次顺序为E＞C＞A＞B＞D，即提取次数＞提取时间＞液料比＞提取温度＞乙醇浓度。

三维响应面及等高线可较直接的反映各因素对迷迭香粗提物的作用。响应面表面的陡峭程度和等高线的密度反映了相互作用的影响程度。响应面越陡，表明该因子对迷迭香物质得率的作用越大，因子之间的交互影响越显著，等高线越接近椭圆表明两个因子间的交互影响显著，即对结果影响更为显著。响应面及等高线见图6。

图6 各因素的等高线和响应面Fig.6 Contour lines and response surfaces of each factor

由图6 可知，所选区域范围中响应面最高点以及等高线的中心点就是迷迭香粗提物得率的最大值，越接近中心点，迷迭香粗提物得率越高。

通过响应面试验分析得到最优工艺条件为液料比7∶1（mL/g）、提取温度78.41 ℃、提取时间61.83 min、乙醇浓度59.26%、提取次数2.87，此时迷迭香粗提物最优得率为32.25%。考虑到实际可操作性，对最佳提取条件优化为液料比7∶1（mL/g）、提取温度78 ℃、提取时间62 min、乙醇浓度60%、提取次数3 次，进行验证试验。在此条件下粗提物得率为（32.40±0.52）%，与理论值无显著性差异。说明此模型预测较好且稳定，可用于迷迭香粗提物提取。

2.3 迷迭香粗提物抑菌作用

近年来，随着各类抗生素的使用，细菌常用抗生素的耐药性逐年攀升。研究表明，迷迭香对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等均有一定的抑菌作用[18-20]。试验结果如图7 和表4 所示。

图7 迷迭香粗提物对食品中常见细菌的抑菌效果Fig.7 Inhibitory effects of crude extract of rosemary on common bacteria in food

表4 迷迭香粗提物抑菌圈直径Table 4 Diameter of inhibition zone of crude extract of rosemary

由图7、表4 可知，迷迭香粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌有较好的抑菌效果，可形成明显的抑菌圈，且迷迭香粗提物对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌拥有更高的抑菌活性，抑菌圈直径显著高于其余两种菌种。

研究表明，迷迭香粗提物主要通过破坏细胞膜和膜介导的凋亡途径来发挥抗菌活性，通过破坏细胞膜的通透性和流动性，导致细胞内部的各种物质泄漏，致使细菌死亡[21]。与郭冬云等[22]的研究结果相比，本试验提取的迷迭香粗提物对金黄色葡萄球菌抑菌能力（抑菌圈直径22.15 mm）高于其抑菌能力[抑菌圈直径（11.45±0.19）mm]，这可能与提取工艺有关[23-24]。李明喆等[25]研究表明，迷迭香中的有效成分迷迭香酸能够进入E.coli细胞，通过调控微生物酶的活性，干扰微生物代谢，从而抑制细菌生长。因此，推测迷迭香粗提物的抑菌机制可能与破坏微生物细胞结构及干扰微生物代谢有关。

2.4 迷迭香粗提物最低抑菌浓度

最低抑菌浓度是评价抗菌活性大小的指标，因此本研究以最低抑菌浓度评价迷迭香粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌的抑菌能力。试验结果如表5 所示。

表5 迷迭香粗提物的最低抑菌浓度Table 5 Minimum inhibitory concentration of crude extract of rosemary

由表5 可知，迷迭香粗提物浓度在50.00 mg/mL时，均可有效抑制受试细菌的生长。当迷迭香粗提物浓度为25.00 mg/mL 时，大肠杆菌出现菌落；当迷迭香粗提物浓度为12.50 mg/mL 时，蜡样芽孢杆菌和绿脓杆菌出现菌落；当迷迭香粗提物浓度为6.25 mg/mL时，金黄色葡萄球菌出现菌落。因此，迷迭香粗提物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果大于蜡样芽孢杆菌和绿脓杆菌，且均大于大肠杆菌。因此，迷迭香粗提物对大肠杆菌的最低抑菌浓度为50.00 mg/mL，对绿脓杆菌和蜡样芽孢杆菌的最低抑菌浓度为25.00 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为12.50 mg/mL。

通过抑菌圈试验和最低抑菌浓度试验结果可以看出迷迭香粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌具有较好的抑菌效果。

3 结论

迷迭香粗提物的最优提取工艺条件为液料比7∶1（mL/g）、提取温度78 ℃、提取时间62 min、乙醇浓度60%、提取次数3 次，在此条件下，迷迭香粗提物的提取率为（32.40±0.52）%。迷迭香粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、蜡样芽孢杆菌均具有一定抑菌效果，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为50 mg/mL，对绿脓杆菌和蜡样芽孢杆菌的最低抑菌浓度为25 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为12.50 mg/mL。本研究优化了迷迭香粗提物提取工艺；同时，抑菌试验结果表明，迷迭香粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、蜡样芽孢杆菌具有有效的抑菌活性，研究结果可为抗生素耐药感染中的天然产物替代开发提供依据。