DNA条形码技术融入普通昆虫学实验教学

康泽辉，孙丽娟，郑桂玲，张 晓

（青岛农业大学植物医学学院，山东青岛 266109）

0 引言

普通昆虫学是植物保护专业的入门课程，是学习昆虫学的基础，也为后续多门课程打下重要基础，是植物保护专业高水平、高质量人才培养的关键课程之一［1-2］。该门课程具有很强的实践性，通过实验教学可以使学生深入了解理论知识，同时也能提高实验技能和科研能力［3］。随着科技的发展，昆虫学研究的方法和技术也在不断更新和发展，然而，在实际的教学过程中，很多实验教学内容都比较传统，尤其是分类学部分实验内容比较单一，缺乏创新性和前沿性，严重限制了学生对昆虫学研究的探索和发展［4-6］。

DNA条形码技术是一种基于DNA 序列的物种鉴定方法，该方法可以应用于各种生物样本，只需极少量的样本即可获得高保真度的DNA条形码序列，而且处理过程简单、速度快，可以实现高精度的物种鉴定。此外，DNA条形码技术具有高度的可重复性和可比性，不受环境因素的影响，具有较高的鉴定准确性［7］。DNA条形码技术在人们的生产生活各个领域都有着广泛的应用，随着技术的不断发展和应用的不断拓展，DNA条形码技术将会在未来的研究和应用中发挥更加重要的作用。因此，在普通昆虫学实验教学中融入DNA条形码技术非常必要。

昆虫分类是普通昆虫学课程的重要组成部分，也是教学中的重点和难点，这方面的教学交流和研讨一直是一个热点。此前的很多研究围绕提高标本质量、运用多媒体技术、改革教学模式（如翻转课堂、互动教学）等方面提出了很多建议［1-3］，但融合最新科研成果和技术方面的研究相对较少［4-6］。利用DNA条形码技术开展分子鉴定在一些生物学、动物学实验课程研究和改革中有所涉及［8-9］，但在普通昆虫学实验教学中的研究还很少。对利用DNA 条形码开展分子鉴定的流程进行全面分析和优化基础上，本文设计了开展DNA条形码专题实验或者将其与传统分类实验结合的实施和考核方案，以期为改变普通昆虫学实验传统教学模式、探索创新性实验教学提供思路。

1 DNA条形码技术

DNA条形码技术可以用于农作物品种鉴定，通过对农作物DNA 测序，可以快速、准确地鉴定不同品种之间的差异和相似性，从而实现对农作物品种的优化和改良［10］。还可以通过对农产品DNA 进行测序，可以快速、准确地鉴定农产品的品种和来源，从而实现对农产品的质量控制和溯源管理。此外，DNA 条形码技术可以通过对不同农作物样本进行DNA测序，了解不同品种之间的遗传关系，从而为农作物的遗传改良提供科学依据［11-12］。相比传统的鉴定方法，DNA条形码技术可以通过测序物种特定基因的序列来确定物种的身份，从而避免了传统鉴定方法中可能存在的误判或漏判等问题。比如有些物种在形态上非常相似，很难通过传统的鉴定方法来区分它们，而DNA条形码技术可以通过测序物种特定基因的序列，来确定物种的身份，从而对于难以区分的物种具有更加明显的优势。

DNA条形码技术在其他领域也有着广泛的应用，可以帮助生态学家准确地鉴定和分类生物物种，从而更好地研究生物群落结构、物种多样性、生态系统功能等生态学问题。例如，在研究食物链中的物种关系时，DNA条形码技术可以确定食物链中不同物种的身份和数量，从而更好地研究食物链的稳定性和影响因素。DNA条形码技术在食品鉴定中也有广泛的应用。通过对食品中的DNA 序列进行分析，可以快速、准确地鉴定食品中是否含有非法添加物或杂质。例如，在鱼类鉴定实验中，可以通过对鱼类DNA 序列进行分析，判断鱼类是否为野生或人工养殖的，是否含有添加物或杂种等。DNA 条形码技术在医学中也有着广泛的应用，可以帮助进行疾病诊断、药物研发等方面的研究。例如，利用DNA条形码技术可以对不同癌症样本进行测序，了解它们之间的遗传关系，为癌症的诊断和治疗提供科学依据。此外，DNA 条形码技术在犯罪侦查中也有着重要的应用价值，可以帮助进行身份鉴定、证据分析等方面的工作。

DNA条形码技术是生命科学领域的前沿技术，掌握该技术可以使学生了解和掌握最新的科技发展动态，提高科技创新能力和创新意识。作为未来的创新型人才，植物保护专业学生需要掌握DNA 条形码技术，以更好地应对未来的挑战和机遇。

2 DNA条形码实验设计

2.1 可行性分析

DNA条形码序列应保证序列信息丰富度和可分辨性，同时应具有一定的保守性，即同一物种的DNA条形码序列应高度相似，而不同物种的DNA条形码序列应有明显差异，以确保物种的可识别性。此外，DNA条形码的分子标记应具有广泛性，以确保能够鉴定到尽可能多的物种。关于DNA 条形码的分子标记选择已有大量讨论和比较分析研究，从目前的研究结果来看，昆虫的标记选择趋向于线粒体细胞色素C 氧化酶亚单位I基因（COI基因）［13］。

线粒体COI基因在昆虫纲多个目的DNA 条形码分子鉴定中已有广泛应用，相关鉴定流程较为成熟，主要包括样品处理、DNA提取、PCR扩增、测序及结果分析。此外，对该技术应用较成熟的检验检疫部门已在2016年颁布了《DNA条形码物种鉴定操作规程》（SN/T4626—2016）。

目前已有较多DNA 条形码序列丰富的基础数据库可供使用，如BOLD 数据库（Barcode of Life Data Systems，http：//www.boldsystems.org/）、NCBI（National Center for Biotechnology Information，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的GenBank数据库等，其中BOLD 数据库中已经有超过1 000 万个DNA 条形码数据。这些数据库包含了充足的线粒体COI 基因序列数据和相关信息，足够覆盖普通昆虫学涉及昆虫类群的数据比对和分析。

综上，目前昆虫在DNA 条形码分子标记的筛选、分子鉴定操作流程、基础数据库建设等方面已较为完善，这些都为本实验的顺利设计提供了坚实基础。

2.2 实验方案

在整合大量文献的基础上，通过验证和摸索，优化了以COI基因序列作为DNA条形码开展分子鉴定的具体流程（见图1），以便在普通昆虫学实验教学中开展DNA条形码专题实验或者将其与传统分类实验结合。

图1 普通昆虫学DNA条形码分子鉴定实验流程图

（1）样品保存。将获取的新鲜昆虫样品浸泡于无水乙醇中，置于-20 ℃冰箱中保存，避免样本腐烂和DNA降解。

（2）DNA提取。DNA提取是DNA条形码分析的关键步骤之一，DNA提取的方法选择会直接影响后续实验的准确性和效果。对于昆虫样本的DNA 提取有以下几种方法：①酚氯仿法。是一种传统的DNA提取方法，该方法具有操作简单、成本低等优点，但是提取的DNA 质量和纯度较低，容易受到污染，不同实验人员操作重复性差，不利于保护RNA，很难进行微量化的操作，且实验过程中会接触苯酚、氯仿等试剂，毒性较大。②离心柱法。优点是比传统的酚氯法提取的质量和纯度高，有利于保护RNA，能进行微量操作，且价格低廉，操作便捷，提取过程不使用苯、氯仿等有毒试剂，逐渐取代了传统DNA 提取方法，是目前较为通用的DNA提取方法。③磁珠法。操作简单快速，能实现高通量、自动化操作，提取效率高且安全无毒。提取过程中只需微量的样本，提取的核酸纯度高、浓度大，且灵敏度高，但该方法依赖于磁力分离装置或自动提取仪，目前价格依然很高。

综合来看，离心柱法更适合于普通昆虫学实验，以天根公司的TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型）为例，该方法的具体操作如下：

①选用昆虫胸部肌肉或者足，个体较小时可利用除腹部和翅以外的全部虫体。将选取的昆虫组织放入1.5 mL离心管中，加入200 μL 缓冲液GA，使用研磨棒进行充分研磨。

②加入20 μL 蛋白酶K 溶液，充分混匀。放入56 ℃水浴锅中消化过夜，直至组织溶解。

③取出离心管，加入200 μL 缓冲液GB，充分颠倒混匀，70 ℃水浴10 min，简短离心。

④加入200 μL无水乙醇，充分震荡约15 s，混匀并简短离心。

⑤将上一步所得溶液转入组装好的吸附柱中，12 000 r/min离心1 min，废液倒掉，将吸附柱放回收集管中。

⑥向吸附柱中加入500 μL缓冲液GD（需提前按要求加入无水乙醇），12 000 r/min离心1 min，废液倒掉，将吸附柱放回收集管中。

⑦向吸附柱中加入700 μL漂洗液PW（需提前按要求加入无水乙醇），12 000 r/min离心1 min，废液倒掉，将吸附柱放回收集管中。

⑧向吸附柱中加入500 μL 漂洗液PW，12 000 r/min离心1 min，废液倒掉。

⑨将吸附柱放回收集管中，12 000 r/min 离心2 min，废液倒掉。将吸附柱打开盖子置于超净工作台中，吹15 min，彻底晾干吸附柱。

⑩将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加入50 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中。DNA产物保存在-20 ℃冰箱中，防止DNA降解。

（3）PCR扩增。

①引物选择。DNA条形码序列主要利用COI 基因序列5′端位于轻链1 490 和重链2 198 之间目的片段。目前LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATA TTGG-3′）和HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAA AAAA TCA-3′）为最为通用的昆虫COI 基因序列扩增的引物［14］，在此基础上改造的LepF1（5′-ATTCAAC CAATCATAAAGATATTGG-3′）和LepR1（5′-TAAACTT CTGGATGTCCAAAAAATCA-3′）目前也较为广泛应用［15］。

②PCR扩增体系和条件。将提取的DNA作为模板，使用COI基因特异性引物进行PCR扩增。参考生工Taq PCR Master Mix 的建议用量，摸索出最适PCR的反应体系Taq PCR Master Mix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，上、下游引物分别为1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：94 ℃预变性，4 min。30 个扩增循环：94 ℃变性，30 s，45～55 ℃复性，30 s，72 ℃延伸，1 min；72 ℃终延伸10 min；10 ℃保温。反应结束后及时取出放入4 ℃冰箱保存。

（4）电泳检测。将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用Gold View 型核酸染色剂染色，上样3 μL的PCR产物进行检测，确认PCR 扩增是否成功并检测DNA 的大小和纯度。凝胶成像系统进行观察并拍照保存。具体步骤如下：

①1%的琼脂糖凝胶制备。称取0.4 琼脂糖置于锥形瓶中，加入40 mL的1*TBE 缓冲液，微波炉中高火加热煮沸至琼脂糖全部融化并摇匀。将凝胶冲水冷却至60 ℃，不烫手时加入4 μL的Gold View型核酸染色剂并混合均匀。

②胶板制备。取洗净晾干的制胶槽放入制胶玻璃板，将梳子放入固定好，将上述凝胶倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，不要产生气泡，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置30 min，至胶完全凝固后垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1*TBE至没过胶板。

③加样。吸取3 μL的PCR产物加入胶板的槽孔里，另加入5 μL Marker作为对照。

④电泳。加样完毕后，立刻通电进行电泳，电压160 V，电流60 mA，样品从负极向正极方向移动，电泳30 min。

⑤观察拍照。电泳完毕后取出凝胶放入凝胶成像系统内观察并拍照保存。

（5）测序和分析。将PCR 产物送至测序公司进行测序。通常使用Sanger测序方法，核苷酸双向测序结果以SEQ 和ABI 格式输出。使用CONTIG 序列编辑软件对测序的COI 结果进行编辑、修剪和校正，输出FASTA 格式序列。序列上传至BOLD 数据库的IDENTIFICATION 板块或NCBI 中的BLAST 进行比对，找出序列相似度最高的物种信息。

2.3 评价考核

本实验重点培养学生的动手能力、科学素养和创新精神。在实验过程中，要鼓励学生进行讨论和交流，分享彼此的观察和发现，让学生在互相学习和交流中不断提高。在实验完成后，要对实验结果进行详细的分析和解读，将实验结果进行对比和验证。通过分析实验结果，让学生更深入地了解基本原理，并能够加深对科研成果的理解和应用。在实验结束后，要求学生撰写实验报告，在报告中应详细描述实验的过程、结果和分析。通过撰写实验报告，让学生能够更全面地理解实验过程和原理，同时也能够提高学生的科学写作能力。

评价考核主要通过观察实验过程，结合实验结果和实验报告进行，重点关注以下几个方面：①实验操作技能，包括实验操作的规范性、熟练性和正确性等指标；②实验报告能力，包括实验报告的完整性、规范性、清晰性和逻辑性等指标；③实验思维能力，包括实验设计的合理性、实验数据的分析能力和实验结果的解释能力等指标；④实验安全意识，包括实验安全规定的遵守程度、实验安全操作的正确性和实验安全问题的处理能力等指标；⑤综合素质，包括学生的学习态度、团队合作能力、创新能力和解决问题的能力等指标。

经评价考核，若学生已经充分掌握了知识内容，并熟练运用知识点内容设计实验方案，并能够在完成基本实验要求的情况下表现出较强的实际动手能力，则评判为A档；若学生基本掌握了知识点，完成了实验内容，表现出了一定的学习能力，则评判为B 档；若学生对知识点内容没有完全理解，不能根据原理和知识点完成实验内容，则评判为C 档，并要求学生继续学习相关知识，熟悉实验操作流程，提升自身的整体能力。

3 结语

将DNA条形码技术融入普通昆虫学实验教学可以提高学生的科研能力和综合素质，促进植物保护专业本科教学的发展。为了实现这个目标，需要拓宽教学内容、创新教学方式，即引入更多的分子生物学知识和技术，如DNA条形码技术与PCR技术、基因测序技术等，从而更好地了解这些技术的原理和应用，并采取更加生动、直观的教学方法，可以通过讲解案例、实验操作和课堂讨论等方式，使学生更好地了解DNA条形码技术的原理和应用。还需要加强实验室建设，提供先进的实验设备和技术支持，如PCR 扩增仪、DNA 测序仪等先进的实验设备，为学生提供更好的实验条件和技术支持。此外，还要加强师资队伍建设，培养更多的专业教师和科研人才，尤其是具有分子生物学背景和实验技能的教师，为学生提供更好的教学和指导。

通过这些努力，在DNA条形码技术融入普通昆虫学实验教学的基础上，未来可以将更多科研成果和技术融入植物保护专业的实验和实践课程中，能够进一步提高学生的科学素养和实践能力，同时也能够激发学生的创新能力，让学生能够更好地应用科学知识解决实际问题。相信按照该模式可以培养更多的创新型人才，进一步发展植物保护事业，为守护国家粮食安全做出更大的贡献。