P2X7R过表达的巨噬细胞MSU晶体诱导痛风炎症反应过程中IL-1β、TNF-α、NLRP3表达观察

秦丽岩，冀琨，陈邬锦，张蓓，孙玉萍，李瑞

1 新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐 830017；2 新疆医科大学第六附属医院神经外科；3 新疆医科大学基础医学院

痛风是晶体相关关节性疾病，可以表现为急性痛风发作、慢性痛风性关节炎或痛风石等［1］。文献［2］报道，尿酸在体内堆积形成单钠尿酸盐（MSU）晶体，可诱导痛风炎症反应。MSU 晶体被巨噬细胞吞噬后，启动先天免疫，激活NOD 样受体家族3（NLRP3）、Toll 样受体和NOD 样受体信号转导通路，产生并分泌IL-1β，促进痛风的进展［3］。但MSU 晶体并不是引起痛风发作的惟一因素，甚至清除MSU 晶体后也不能阻止痛风的发作［4］。嘌呤能受体P2X 配体门控离子通道7 的配体（P2X7R）是嘌呤能受体P2X 家族的重要成员，在人体的固有免疫中发挥重要作用，当细胞外三磷酸腺苷（ATP）浓度发生变化时，P2X7R 被活化，此时引起细胞内钾外流，激活NLRP3 蛋白，并进一步分泌IL-1β，引起炎症反应［5］。然而，痛风的发生是否与P2X7R 的活化并激活NLRP3 蛋白有关鲜有报道。2022 年5 月—2023 年5 月，我们观察了P2X7R过表达白血病细胞诱导分化的巨噬细胞MSU 晶体诱导痛风炎症反应过程中IL-1β、TNF-α、NLRP3 蛋白表达情况，旨在为探讨痛风发作的分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、慢病毒载体及主要试剂、仪器 人单核细胞白血病细胞系THP-1 购自武汉普诺赛生命科技有限公司；慢病毒载体V1000532-1 PDS279_pLCMV-GFP-ccdB-puro-P2X7R（P2X7R 过表达慢病毒载体）和V1000532-2 PDS279_pL-CMV-GFP-ccdBpuro-blank（P2X7R 过表达慢病毒空载体）购自北京擎科生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液购自Gibco公司，FBS 和双抗购自Sciencell 公司，THP-1 细胞专用培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，MSU 购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）购自MultiSciences 公司，RNA 提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，逆转录试剂盒购自上海赛默飞世尔科技有限公司，Real Time PCR EasyTM-SYBR Green Ⅰ试剂盒购自成都福际生物技术有限公司，高效RIPA 组织/细胞快速裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、4×蛋白上样缓冲液、甘氨酸、三氨基甲烷和吐温-20 购自Solarbio 公司，Easy See Western blot kit购自Trans 公司，SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒和中分子量蛋白marker 购自Biosharp 公司，RB A beta-Actin 和NLRP3 抗体购自Bioss 公司，P2X7R 抗体购自Abcam 公司，ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。气套式触屏CO2恒温培养箱购自美国精骐公司，低速台式离心机、高速冷冻离心机购自湖南湘仪公司，涡旋仪购自其林贝尔公司，生物安全柜购自苏净安泰公司，倒置生物显微镜系统和荧光显微镜购自宁波舜宇仪器有限公司，数显恒温水浴锅购自上海力辰邦西仪器科技有限公司，立式高压蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械公司，微量移液器购自德国赛多利斯集团，微量振荡器购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司，荧光定量PCR 仪购自杭州朗基科学仪器有限公司，Bio 小型垂直电泳及转印购自Bio-Rad Laboratories公司，水平脱色摇床和化学发光成像购自北京六一生物科技有限公司，酶标仪购自北京凯奥科技发展有限公司。

1.2 THP-1 细胞分组、P2X7R 过表达质粒转染及THP-1 细胞诱导分化为巨噬细胞、MSU 晶体诱导痛风炎症反应过程 THP-1 细胞培养于THP-1 细胞专用培养基，置于37 ℃、含有5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到90%左右时进行传代。将培养至第三代的细胞接种于6 孔板中，37 ℃培养过夜，第2 天观察细胞，密度在30%～40%时，将细胞随机分为过表达组、空白组、模型组、对照组。将200 μL 滴度为1×108TU/mL 的P2X7R 过表达质粒、空白质粒分别加入过表达组和空白组，十字交叉法混匀后放入细胞培养箱过夜，第3 天给细胞换正常培养基，继续培养72 h。将过表达组、空白组和模型组细胞用100 ng/mL 的PMA 刺激3 h 后分化为巨噬细胞，另将MSU 晶体用氢氧化钠溶解配制成浓度为100 μg/mL的MSU乳糜状悬液并加入细胞培养液中孵育6 h。收取巨噬细胞和巨噬细胞上清液，以备下一步实验使用。

1.3 巨噬细胞P2X7R mRNA、蛋白相对表达量测算 ①P2X7R mRNA：采用RT-PCR 法。取各组细胞，吸弃培养基后，每孔加入1 mL 的TRIzol 充分裂解细胞，然后吸至离心管中。按照RNA 提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，测定RNA 浓度后，按照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，以cDNA 为模板进行实时荧光定量PCR。引物序列：P2X7R：F-AGCTCGCAAACCATTCTCCA，R-TGTGTAAACGTGGACGGGAG；β-actin：F-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT，R-GCTGTCACCTTCACCGTTCC。荧光定量程序设定为预变性94 ℃、3 min，变性94 ℃、5 s，退火60 ℃、20 s。②P2X7R 蛋白：采用Western blot 法。各组细胞中加入1 mL 的TRIzol 充分裂解细胞，然后吸至离心管中，向离心管中加入等体积5×loading buffer，置于金属浴中煮20 min 提取细胞总蛋白，按照BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白定量。选择10%配胶试剂盒配胶，待检测蛋白样品上样量为20 μL。电泳（浓缩胶恒压70 V，约20 min；分离胶恒压110 V），电泳停止后转膜，转膜条件为恒流230 mA，150 min。转膜结束后将膜置于牛奶中封闭1 h，孵育一抗（一抗采用1∶10 000浓度稀释，孵育1 h）和二抗（二抗采用1∶20 000浓度稀释，孵育1 h），化学发光成像系统曝光，保存图片。

1.4 巨噬细胞上清液IL-1β、TNF-α 检测 采用ELISA 法。取各组细胞上清液，严格按照ELISA 试剂盒操作要求进行操作。设置标准品孔、空白对照孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。样本孔中加40 μL 样本稀释液，然后再加待测样本10 μL；空白对照孔不加样本及酶标试剂。标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化酶（HRP）标记的待测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5 次。每孔加入底物A、B 各加50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min 内在450 nm 波长处测定各孔的OD 值。

1.5 巨噬细胞NLRP3 蛋白相对表达量测算 分组及检测方法与“1.3中②”相同。

1.6 统计学方法 采用SPSS23.0 软件和Graph Pad Prism7.0 软件。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组巨噬细胞P2X7R mRNA、蛋白相对表达量比较 巨噬细胞P2X7R mRNA、蛋白相对表达量比较见表1。

表1 各组巨噬细胞P2X7R mRNA、蛋白相对表达量比较（）

表1 各组巨噬细胞P2X7R mRNA、蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与过表达组比较，cP＜0.05。

P2X7R蛋白0.24 ± 0.02ab 0.18 ± 0.01ac 0.20 ± 0.03a 0.12 ± 0.01组别过表达组空白组模型组对照组P2X7R mRNA 3.62 ± 0.28ab 2.25 ± 0.16ac 2.44 ± 0.54a 1.02 ± 0.27

2.2 各组巨噬细胞上清液IL-1β、TNF-α水平比较巨噬细胞上清液IL-1β、TNF-α水平比较见表2。

表2 各组巨噬细胞上清液IL-1β、TNF-α水平比较（）

表2 各组巨噬细胞上清液IL-1β、TNF-α水平比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与过表达组比较，cP＜0.05。

TNF-α 78.71 ± 1.90ab 72.74 ± 2.53ac 72.86 ± 1.51a 65.82 ± 2.81组别过表达组空白组模型组对照组IL-1β 67.12 ± 1.48ab 59.81 ± 0.94ac 61.57 ± 2.42a 54.42 ± 2.21

2.3 各组巨噬细胞NLRP3 蛋白相对表达量比较过表达组、空白组、模型组、对照组巨噬细胞NLRP3蛋白相对表达量分别为0.95 ± 0.10、0.71 ± 0.08、0.80 ± 0.06、0.60 ± 0.07，过表达组、模型组分别与对照组比较，过表达组与模型组、空白组比较，P均＜0.05。

3 讨论

痛风是一种炎症性关节炎，虽然是自限性疾病，但急性发作时严重影响患者的生活质量，而且随着经济的发展，痛风的发病率也有所增加，因此越来越引起公众关注［6］。痛风是高尿酸血症进展而来，MSU 在关节腔中析出后可作为危险信号激活NLRP3，从而招募ASC（凋亡相关斑点样蛋白）和Caspase-1 组成NALP3 炎性小体，使得IL-1β成熟并分泌，驱动炎症反应，导致患者受累关节肿胀、疼痛。此外也有研究证实，MSU 不仅能激活NOD 样炎性信号通路诱导炎症，而且作为跨膜蛋白的Toll 样受体也能感受到MSU，从而激活细胞内衔接蛋白MyD88，使得核因子-κB（NF-κB）向细胞核移动，最终合成并释放IL-1β，参与痛风的发病［7-9］。但随着对痛风研究的不断深入发现，并非所有高尿酸血症患者都会发生痛风的急性发作，故不能单纯的认为仅有MSU 晶体就会发生痛风，痛风的发作还存在其他致病信号［10］。THP-1 是人单核细胞白血病细胞，经PMA 刺激后会诱导分化为巨噬细胞，而MSU 晶体可以刺激巨噬细胞促进炎症并激活免疫细胞，导致促炎介质和趋化因子的释放引发痛风。此外，现在越来越多的研究发现，巨噬细胞在痛风发作的开始、进展及消退过程中都发挥作用［11］。虽然目前关于痛风发病机制的研究众多，但关于巨噬细胞在痛风发生过程中发挥的作用研究较少，因此本研究选用THP-1 细胞，经PMA 诱导分化为巨噬细胞后通过过表达P2X7R，探讨P2X7R 与痛风炎症反应间的关系，为深入挖掘痛风的发病机制提供实验数据，为今后寻找防治痛风的药物靶点提供线索。

P2X7R 是一种ATP 门控离子通道受体，其可感受细胞外ATP 水平变化［12］。当受高浓度ATP 持续刺激时，P2X7R 被激活，形成离子通道及孔道，允许大分子通过，同时使钙离子由胞外进入细胞，钾离子从细胞流出，这些变化就会激活先天免疫系统中的NLRP3 炎症小体［13］。NLRP3 被激活后，会与ASC 相互作用，进而招募Caspase-1 形成NLRP3 炎症小体，炎症小体经裂解使Caspase-1 有活性，经进一步加工后，产生并分泌成熟IL-1β，引起炎症［14］。因此，ATP/P2X7R 信号通路可以与其他致病信号协同参与炎症性疾病的发病过程［15-16］。酗酒、暴饮暴食、劳累、寒冷、熬夜等都是痛风发作的诱发因素。在这些致病信号的刺激下，机体ATP 水平会波动，如剧烈运动时的机械刺激会激活AMP 蛋白激酶，使得ATP 利用减少，产生增加；寒冷环境下，机体的适应性发热也会增加ATP 水平；饮酒会促进ATP 合成酶的表达，从而提高ATP 的浓度等。而当MSU 晶体在关节腔沉积后会引起关节周围组织坏死，此种情况下，细胞释放产生的局部ATP 水平也会增加。增加的ATP 就会激活P2X7R，从而使细胞内外发生离子流，活化NLRP3 炎症小体，最终释放大量IL-1β，触发痛风的急性炎症反应［17-19］。因此认为ATP 是除MSU 晶体外引起痛风发作的关键致病信号，而P2X7R 的表达是炎症级联反应的关键。综上，本研究通过过表达P2X7R，在细胞痛风炎症反应中探讨P2X7R 与NLRP3 炎症小体及炎症因子间的关系，旨在表明P2X7R 可能作为痛风发作的致病信号。

NLRP3 是一种具有特殊功能（传感器和效应器）的模式识别受体，在无菌性炎症性疾病和抗菌防御中具有重要作用［20］。近年来的研究数据显示，NLRP3 炎性小体在痛风发作过程中发挥举足轻重的作用。NLRP3 的激活一方面是由于脂多糖激活NF-κB 信号通路，促进NLRP3 炎症小体成分的表达，而另一方面则是由于MSU 晶体被巨噬细胞摄取后促进NLRP3 炎性小体的组装和活化。活化的NLRP3 炎性小体可进一步触发下游炎症信号级联反应，其中就包括促炎细胞因子的产生及释放［21］。IL-1β 和TNF-α 都是典型的促炎细胞因子，而且先前的研究已经证实MSU 晶体可以促进单核细胞来源的巨噬细胞分泌IL-1β，与痛风的炎症反应密切相关［22］。因此，本研究探讨了P2X7R 与NLRP3 炎性小体及促炎细胞因子IL-1β 和TNF-α 间的关系，旨在表明P2X7R 可能是痛风炎症反应的另一个触发因素。本研究结果显示，P2X7R mRNA 相对表达量在过表达组最高，与对照组、模型组和空白组差异均有统计学意义。P2X7R 和NLPR3 蛋白相对表达量均在过表达组最高，且与对照组、模型组和空白组差异有统计学意义。因此，本实验结果说明，NLRP3、IL-1β 和TNF-α 水平会随P2X7R 水平的增高而增高，P2X7R 参与了MSU 晶体诱导的痛风炎症反应。

总之，P2X7R 参与了MSU 晶体诱导的痛风炎性因子IL-1β 和TNF-α 的产生并释放，且可能通过激活NLRP3蛋白来实现。