β-环糊精-聚乙二醇-7-乙基-10-羟基喜树碱胶束在大鼠体内的药动学研究

彭于之 ，姜良竹 ，徐传锡 ，王志强，孙勇兵*

1.江西中医药大学 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330004

2.江西中医药大学 药学院，江西 南昌 330004

伊立替康是喜树碱类拓扑异构酶I 抑制剂[1]，用于转移性结直肠癌、胰腺癌等的临床治疗。伊立替康本质上是一种前药，需要在羧酸酯酶作用下转化为活性代谢物7-乙基-10-羟基喜树碱（SN38）才能发挥疗效[2]。然而，仅有2%～8%的伊立替康可转化为活性的SN38。SN38 在多种肿瘤细胞株上表现出比伊立替康高10～1 000 倍的抗肿瘤活性[3-5]。直接用SN38 作为抗癌药物无需体内酯酶的激活，可以克服伊立替康的代谢激活缺陷。目前开发SN38靶向给药系统已成为大型制药企业竞相开展的重要课题。浙江海正药业开发的SN38 胶束制剂PEGSN38 已经进入了I 期临床[6-7]；日本化药株式会社开发的载SN38 胶束制剂NK012 已经进入II 期临床，而且被美国食品药品管理局批准作为治疗非小细胞肺癌的治疗药物[8-9]。SN38 脂质体的研究也是一个热门[10-11]。在前期研究中，本课题组以β-环糊精-聚乙二醇作为亲水端，通过酯键将SN38 的20位羟基与β-环糊精-聚乙二醇相连，构建了两亲性聚合物β-环糊精-聚乙二醇-7-乙基-10-羟基喜树碱胶束（β-CD-PEG-SN38），该聚合物能在水性介质中自组装成100 nm 左右的胶束。为了更好地了解β-CDPEG-SN38 在体内的动态行为，开展其的药动学研究是非常有必要的。本研究建立了HPLC-MS/MS 法测定大鼠血浆中游离型和键合型SN38，考察了β-CD-PEG-SN38 胶束在大鼠体内的药动学，以期为新药开发提供更多的支持。

1 仪器和材料

Nexera LC-40 超高效液相系统（配备自动进样器和二元泵，日本Shimadzu 公司），API4500 三重四级杆质谱仪（美国AB Sciex 公司），ST8R 超高速离心机（美国Thermo Fisher 公司）。

SN38 原料药[质量分数大于 99.8%，批号20221005，凯立德生物医药技术（上海）有限公司]，盐酸小檗碱（质量分数大于99.5%，批号20221021，江西本草天工科技有限公司）。甲醇、乙腈（色谱级，美国Fisher Scientific 公司），甲酸（色谱级，上海麦克林公司），纯净水（自制），其余试剂均为分析纯。

β-CD-PEG-SN38 胶束由江西中医药大学自制，HPLC 法测得SN38 的载药量为11.2%。SD 大鼠由江西中医药大学实验动物中心提供，动物使用许可证号SYXK（赣）2022-0002。药动学实验得到江西中医药大学实验动物伦理委员会批准。

2 方法和结果

2.1 色谱和质谱条件

色谱条件：月旭Welch C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为水（含0.1%的甲酸溶液，A）-乙腈（含0.1%的甲酸溶液，B），梯度洗脱（洗脱程序为0～0.4 min，5% B；0.4～4.5 min，5%～80% B；4.51～6.0 min，80%～5% B）；柱温是40 ℃；体积流量0.2 mL/min；进样量是1 μL。

质谱条件：ESI 源，正离子检测，多反应监测（MRM）方式扫描；离子通道：393.1→349.1（SN38），336.1→320.0（内标小檗碱）。源电压为5 500 V，Gas1（N2）为60 psi（1 psi＝6 895 Pa），Gas2（N2）为60 psi，离子源温度是600 ℃；Curtain gas（N2）为40 psi，CAD Gas（N2）为9 psi。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准溶液和质量控制（QC）标准溶液的制备 精密称取SN38 对照品适量，用70%甲醇溶液制备272.0 μg/mL 储备液，然后用70%甲醇溶液依次稀释制备标准曲线工作溶液，SN38 的质量浓度分别为68.0、340.0、680.0、1 360.0、2 720.0、5 440.0、13 600.0、27 200.0、43 520.0、54 400.0 ng/mL。按照同样的方式制备SN38 低、中、高质量浓度（136.0、27 200.0、43 520.0 ng/mL）的QC 标准溶液。所有溶液置于冰箱（4 ℃）保存。

2.2.2 内标溶液的制备 精密称取小檗碱对照品适量，用70%甲醇溶液制备400 μg/mL 储备液，然后用70%甲醇溶液稀释制备250 ng/mL 内标溶液，置于冰箱（4 ℃）保存。

2.3 血浆样品的处理

2.3.1 标准曲线和QC 血浆样品的制备 取标准曲线溶液和QC 工作溶液10 μL，置于具塞玻璃试管中，用氮气吹干，加入空白血浆200 μL，配制SN38 质量浓度在3.4～2 720.0 ng/mL 标准曲线血浆样品，同时制备SN38 低、中、高质量浓度分别是6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的血浆QC 样品。

2.3.2 血浆样品的制备 将40 μL 血浆样品置于1.5 mL 离心管中，加入10 μL 内标小檗碱工作溶液、20 μL 水，涡旋2 min，加入330 μL 甲醇溶液，涡旋5 min，于4 ℃、10 000 r/min 离心8 min，取上清液，即得游离型SN38 测定的血浆样品溶液。将40 μL 血浆样品置于1.5 mL 离心管中，加入1 mol/L氢氧化钠溶液10 μL，23 ℃孵育10 min，然后加入1 mol/L 盐酸溶液10 μL，再加入10 μL 内标小檗碱工作溶液，涡旋2 min，加入330 μL 甲醇溶液，涡旋5 min，于4 ℃、10 000 r/min 离心8 min，取上清液，即得SN38 总质量浓度（键合型和游离型之和）测定的血浆样品溶液。质量浓度超过标准曲线最高点的样品用空白血浆稀释10 倍后测定。

2.4 方法学试验

2.4.1 方法选择性 取6 个不同来源的大鼠空白血浆40 μL，除不加入内标小檗碱溶液（补加70%甲醇10 μL），其余按照2.3.2 项下方法操作，得空白血浆样品；取含SN38 6.8 ng/mL 的低质量浓度QC样品40 μL，加入10 μL 内标小檗碱工作溶液，其余按照2.3.2 项下方法操作，得低质量浓度QC 样品；取受试大鼠给药后的血浆40 μL，按照2.3.2 项下方法操作，得大鼠给药样品。取各样品进样测定，色谱图见图1。可以看出SN38 的保留时间为3.923 min，内标物小檗碱的保留时间为3.805 min，血浆中的内源性成分不干扰SN38、小檗碱的测定。

图1 空白血浆（A）、QC 样品（B）和大鼠给药样品（C）的MRM 色谱图Fig.2 MRM chromatograms of blank plasma (A),QC sample (B),and sample from rat (C)

2.4.2 线性回归曲线方程 取标准曲线血浆样品40 μL，加入10 μL 内标小檗碱溶液，按2.3.2 项下方法操作，每个质量浓度进行双样本分析，分别以质量浓度（x）为横坐标，以待测物和内标的峰面积比（y）为纵坐标，以加权（y＝1/x2）最小二乘法进行线性回归，得典型的线性回归曲线方程y＝4.356×10-4x＋2.43×10-4，r＝0.992 3，结果表明SN38 的血浆质量浓度在3.4～2 720.0 ng/mL 线性关系良好。

2.4.3 精密度和准确度试验 精确配制6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的血浆样品，各5 份，按2.3.2项下方法操作，测定药物质量浓度，同一个质量浓度样品每隔1 h 测定1 次，共3 次，进行日内精密度计算；每隔1 d 测定1 次，共3 次，进行日间精密度计算，结果见表1。在3 种质量浓度下，日内精密度小于6.5%，日间精密度小于6.3%。

表1 精密度试验结果（,n=5）Table 1 Results of precision test (,n=5)

表1 精密度试验结果（,n=5）Table 1 Results of precision test (,n=5)

分别配制6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 血浆样品，各5 份，按2.3.2 项下方法操作，按标准曲线法计算质量浓度和准确度，见表2。根据药物临床前药动学指导原则，准确度应在85%～115%，RSD 值应小于15%，3 种质量浓度下准确度均符合要求。

表2 准确度试验结果（,n=5）Table 2 Results of accuracy test (,n=5)

表2 准确度试验结果（,n=5）Table 2 Results of accuracy test (,n=5)

2.4.4 方法提取回收率和基质效应 配制SN38 质量浓度分别是6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的QC 血浆样品。取血浆样品40 μL，加入10 μL 内标小檗碱溶液，其余按2.3.2 项下方法操作，测得峰面积A1；另取空白血浆40 μL，先经甲醇沉淀后，加入QC 标准工作溶液，制备未经提取的QC 样品，测得峰面积A2；取混合后的QC 标准工作溶液10 μL，除以水代替空白基质外，其余按2.3.2 项下操作，制备无基质的QC 样品，测得峰面积A3。以提取后的样品峰面积A1除以未经提取的样品峰面积A2计算待测物SN38 和内标小檗碱的回收率。以未经提取的样品峰面积A2除以无基质样品峰面积A3分别计算待测物和内标的基质效应，结果见表3。SN38 的提取回收率在88.5%～95.7%，基质效应在96.4%～103.2%。内标小檗碱的提取回收率和基质效应分别是92.1%、98.3%。

表3 提取回收率和基质效应试验结果（,n=5）Table 3 Result of extraction and matrix effect (,n=5)

表3 提取回收率和基质效应试验结果（,n=5）Table 3 Result of extraction and matrix effect (,n=5)

2.4.5 稳定性试验 配制SN38 质量浓度分别是6.8、2 176.0 ng/mL 的血浆样品，考察样品室温放置2 h、3 个冻融循环（-20～23 ℃）、4 ℃放置24 h、长期放置30 d（-20 ℃）的稳定性，以及处理后的样品的稳定性。结果见表4。

表4 稳定性试验结果（,n=5）Table 4 Result of stability (,n=5)

表4 稳定性试验结果（,n=5）Table 4 Result of stability (,n=5)

2.5 药动学研究

取SD 大鼠12 只，实验前禁食给水过夜，随机分成2 组。大鼠iv β-CD-PEG-SN38 胶束溶液，剂量以SN38 计为6 mg/kg，给药后观察大鼠的腹泻情况，同时用乙醚麻醉大鼠，在5、15、30、45 min 以及1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、48 h 眼眶取血0.2 mL。在4 ℃、2 000 r/min 条件下离心10 min，分离血浆，并于-20 ℃冰箱中保存待测。

将同一份血浆分为两份，各40 μL，按照2.3.2项下方法处理，其中1 份用来测定血浆中游离型的SN38 质量浓度，另1 份用来测定血浆中SN38 总质量浓度（键合型和游离型之和），其中血浆中SN38的总质量浓度减去游离型的SN38 质量浓度就是键合型的SN38 质量浓度。

利用Das 软件计算β-CD-PEG-SN38 胶束溶液中SN38 的药动学参数。平均血药浓度-时间曲线见图2，主要药动学参数见表5。结果发现，利用Das 软件处理药动学数据，三室模型能最佳的进行药动学数据的拟合。大鼠iv β-CD-PEG-SN38 胶束溶液后，游离型SN38 和键合型SN38 的AUC 分别是1 490.7、5 060.3 ng/(mL·h)，在大鼠血浆中占主导的是键合型的SN38。

表5 药动学参数（）Table 5 Pharmacokinetics parameters ()

表5 药动学参数（）Table 5 Pharmacokinetics parameters ()

图2 大鼠体内平均血药浓度-时间曲线（,n=6）Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of SN38 in rats (,n=6)

3 讨论

本研究建立了测定血浆中SN38 质量浓度的HPLC-MS/MS 方法，通过碱性水解的方法将键合型的SN38 从β-CD-PEG-SN38 胶束上断裂出来，血浆中SN38 的总质量浓度减去游离型的SN38 质量浓度就是键合型SN38 的质量浓度。利用沉淀蛋白法处理样品，操作简单；方法的基质效应很低，适合高通量的药物测定。

聚合物胶束制备工艺简单，胶束能以一个完整的形式达到肿瘤部位，实现肿瘤靶向性。两亲性聚合物胶束的药动学研究是一个具有挑战性的难题。从本研究结果可以看出，键合型SN38 质量浓度显著高于游离SN38 的质量浓度，说明胶束在血浆中具有较好的稳定性，SN38 会更多地以胶束的形式靶向肿瘤部位。键合型SN38 的表观分布容积大，说明胶束在组织中尤其是肿瘤组织中分布较多[7]。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突