吲哚-1,3,4-二唑类衍生物的合成及其体外抗肿瘤活性研究

郑煦阳 ，李凌宇，胡玥，尚海*，邹忠梅 *

1.天津中医药大学 研究生院，天津 301600

2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

天然产物是发现新型生物活性分子的重要源泉[1]。其中含有5-(3-吲哚基)唑结构的天然产物表现出多种生物活性，如抗病毒[2]、抗菌[3]、抗癌[4]、抗氧化[5]、抑制细胞增殖[6]和杀虫活性[7]。从丁香假单胞杆菌的发酵产物中分离出来的labradorin 1 就是一种含有5-(3-吲哚基)唑母核结构的天然产物，其对人肿瘤细胞系MCF-7、KM20L2 表现出明显的抗增殖活性，GI50值分别为3.9、3.5 µg/mL[8]。1,3,4-二唑是一种含有1 个氧原子和2 个氮原子的五元芳香杂环化合物，具有广泛的生物活性，包括抗癌[9]、抗微生物[10]、抗真菌[11]、抗炎[12]和抗艾滋病[13]。值得注意的是，由于其独特的结构，常常作为重要的药效团出现在抗肿瘤药物设计中。本研究以labradorin 1 为研究对象，采用骨架跃迁策略，将labradorin 1 中的唑环替换为1,3,4-二唑环，设计并合成了15 个吲哚-1,3,4-二唑类化合物，其结构均经1H-NMR、13C-NMR 和HR-ESI-MS 进行确证。通过MTT 法测试了目标化合物对HeLa、SCG-7901 和MDA-MB-231 3 种肿瘤细胞的体外抗增殖活性，并筛选出活性较好的化合物，进行了作用机制研究。

1 仪器与试剂

Bruker AV III 600 核磁共振仪（北京布鲁克科技有限公司）；Waters SYNAPT G2 HDMS 高分辨质谱仪（上海沃特世科技有限公司）；Mettler-AB104-S 分析天平（梅特勒托利多测量设备有限公司）；IKARCT basic 磁力搅拌器（德国艾卡仪器设备有限公司）；EYELA-N1100 旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；DLSB-5/20 型低温冷却循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；H1 型多功能酶标仪（美国Biotek 公司）；FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD公司）；多功能成像分析系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；PSC603-07S 型荧光显微镜（美国OPLENIC 公司）；薄层色谱板GF254（烟台化工厂）；快速柱色谱用硅胶（200～300 目，青岛海洋化工厂）。

吲哚-3-甲酰肼（毕得科技有限公司），3,3,3-三氟丙酸乙酯、苯胺、异丙胺、苄胺、对氟苄胺、邻氟苄胺、间氟苄胺、对甲基苯胺、对甲基苄胺、对溴苄胺、对氟苯胺、对氯苯胺、苯乙胺、3-氨甲基吡啶、2-呋喃甲胺、对溴苯胺均购自北京伊诺凯科技有限公司；HATU（韶远科技有限公司），DIEA（安耐吉化学），碳酸钠、氢氧化钠（北京通广精细化工有限公司）；其余试剂均为分析纯，购于天津北联精细化学品开发公司。

人宫颈癌细胞HeLa、人胃癌细胞SCG-7901、人乳腺癌细胞MDA-MB-231 和人胚肺成纤维细胞CCC-HPF-1 均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，二甲亚砜（DMSO，上海阿拉丁试剂有限公司）；噻唑蓝（MTT，碧云天生物技术有限公司）、胎牛血清（货号10099-141）、DMEM 高糖培养基（货号8122175）、青霉素-链霉素（货号15140-122）购自Gibco 公司；2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，HY-D0940-5 mg，MedChemExpress 公司）；含DAPI 抗荧光淬灭封片液（P0131-5 mL）购自碧云天生物技术有限公司；Annexin V-APC/PI 细胞凋亡试剂盒（AP107-100T）购自联科生物技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 化合物的合成

以吲哚-3-甲酰肼为起始原料，通过［4+1］环加成反应、水解反应和缩合反应得到目标化合物，合成路线见图1。

图1 化合物6a～6o 的合成路线Fig.1 Synthetic route of compounds 6a — 6o

2.1.1 化合物3的合成 将吲哚-3-甲酰肼（100 mg，0.57 mmol）、3,3,3-三氟丙酸乙酯（82.5 µL，0.63 mmol）、Na2CO3（90.6 mg，0.85 mmol）和无水乙醇（3 mL）依次加入一个干燥的密封管中。将混合物加热至90 ℃反应7 h，TLC 监测反应完全。将反应液冷却至室温，硅藻土滤过，并用醋酸乙酯洗涤，浓缩滤液，残余物经硅胶柱色谱纯化，得到化合物3（160 mg，产率88%）。1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：12.03（s，1H)，8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.08（d，J＝7.5 Hz，1H，7.53（d，J＝7.8 Hz，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.7、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.0、7.0、1.2 Hz，1H），4.25（s，2H），4.17（q，J＝7.2 Hz，2H），1.22（t，J＝7.1 Hz，3H）。

2.1.2 化合物4 的合成 将化合物3（0.59 mmol）溶于四氢呋喃（2 mL）中，加入10% NaOH 水溶液1 mL，室温搅拌0.5 h，TLC 监测反应完全。反应液浓缩至1 mL，加入稀盐酸调pH 值至2 左右，析出白色固体，抽滤，收集滤饼，得化合物4（83 mg，产率58%）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：13.15（s，1H），12.08（s，1H），8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.08（d，J＝7.6 Hz，1H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H），7.28～7.21（m，2H），4.12（s，2H）。

2.1.3 化合物6a～6o 的合成 将化合物4（0.29 mmol）和胺类化合物5（0.37 mmol）溶于DMF（2 mL）中，依次加入HATU（0.37 mmol）和DIEA（0.37 mmol），室温搅拌2 h，TLC 监测反应完全。将反应液倒入水中，用醋酸乙酯（20 mL×3）萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，滤过，减压浓缩至析出大量固体，抽滤，滤饼依次用石油醚、二氯甲烷洗涤，收集滤饼，干燥，得到化合物6a～6o。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-苯乙酰胺（6a）：白色固体，收率45.6%。mp 252.0～253.2 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ12.01（s，1H），10.47（s，1H），8.16（d，J＝2.7 Hz，1H），8.09（d，J＝7.8 Hz，1H），7.60（d，J＝7.5 Hz，2H），7.52（d，J＝8.0 Hz，1H），7.34（t，J＝7.5 Hz，2H），7.26（ddd，J＝7.5、6.6、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.6、7.0、1.3 Hz，1H），7.09（t，J＝ 7.4 Hz，1H），4.18（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.5，162.3，159.6，138.7，136.4，128.9（2C），128.1，124.1，123.7，122.9，121.2，120.2，119.2（2C），112.5，99.4，33.6；HR-MSm/z：319.119 5 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(对甲苯基)乙酰胺（6b）：白色固体，收率54.6%。mp 249.1～251.6 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.8 Hz，1H），10.37（s，1H），8.15（d，J＝2.8 Hz，1H），8.09（d，J＝7.5 Hz，1H），7.53（d，J＝8.0 Hz，1H），7.49（d，J＝8.5 Hz，2H），7.26（ddd，J＝7.4、6.5、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.5、7.4、1.3 Hz，1H），7.14（d，J＝8.3 Hz，2H），4.16（s，2H），2.26（s，3H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.2，162.3，159.7，136.4，136.2，132.7，129.3（2C），128.1，124.1，122.8，121.2，120.2，119.2（2C），112.4，99.4，33.5，20.5；HR-MSm/z：333.135 2 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氟苯基)乙酰胺（6c）：白色固体，收率63.5%。mp 262.7～264.8 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ12.01（d，J＝1.7 Hz，1H），10.53（s，1H），8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.09（d，J＝7.8 Hz，1H），7.64～7.61（m，2H），7.53（d，J＝8.0 Hz，1H），7.27（ddd，J＝7.5、6.6、1.3 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.3、7.0、1.2 Hz，1H），7.20～7.16（m，2H），4.17（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：164.4，162.4，159.6，158.2（d，J＝240.5 Hz），136.4，135.1（d，J＝2.0.Hz），128.1，124.1，122.9，121.2，121.0（d，J＝7.8 Hz），120.2，115.5（d，J＝21.6 Hz），112.5，99.4，33.5；HR-MSm/z：337.110 1 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氯苯基)乙酰胺（6d）：白色固体，收率49.0%。mp 254.5～256.0 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.02（d，J＝2.1 Hz，1H），10.61（s，1H），8.16（d，J＝2.9 Hz，1H），8.10（d，J＝7.5 Hz，1H），7.65～7.63（m，2H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H），7.40～7.38（m，2H），7.27（ddd，J＝7.7、6.6、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.2、7.8、1.2 Hz，1H），4.20（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.8，162.5，159.6，137.8，136.6，128.9（2C），128.2，127.4，124.2，123.0，121.3，120.9（2C），120.3，112.6，99.5，33.8；HR-MSm/z：353.080 5[M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-溴苯基)乙酰胺（6e）：白色固体，收率34.8%。mp 256.3～258.0 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.02（d，J＝1.8 Hz，1H），10.61（s，1H），8.12（d，J＝2.3 Hz，1H），8.08（d，J＝7.5 Hz，1H），7.59（d，J＝7.5 Hz，2H），7.54～7.52（m，3H），7.27（ddd，J＝7.6、6.5、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.2、7.0、1.2 Hz，1H），4.20（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ164.9，162.4，159.5，138.1，136.4，131.7（2C），128.1，124.1，122.9，121.2（2C），121.1，120.2，115.3，112.5，99.4，33.7；HR-MSm/z：397.030 0 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-苄基乙酰胺（6f）：白色固体，收率 64.5%。mp 237.2～239.2 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.87（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.9 Hz，1H），8.08（d，J＝7.9 Hz，1H），7.53（d，J＝7.7 Hz，1H），7.35～7.30（m，4H），7.28～7.23（m，3H），4.34（d，J＝5.9 Hz，2H），4.00（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ165.6，162.2，159.9，139.0，136.4，128.4（2C），128.0，127.3（2C），127.0，124.1，122.9，121.2，120.2，112.5，99.5，42.5，32.6；HR-MSm/z：333.135 2 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-甲基苄基)乙酰胺（6g）：白色固体，收率55.2%。mp 243.0～245.6 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.5 Hz，1H），8.81（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.9 Hz，1H），8.07（d，J＝7.8 Hz，1H），7.53（d，J＝8.3 Hz，1H），7.27（ddd，J＝7.6、6.6、1.3 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.2、7.0、1.1 Hz，1H），7.19（d，J＝7.9 Hz，2H），7.14（d，J＝7.9 Hz，2H），4.29（d，J＝5.9 Hz，2H），3.97（s，2H），2.28（s，3H）；13C-NMR（150 MHz，DMSOd6）δ165.5，162.2，159.9，136.4，136.0，135.9，128.9（2C），128.0，127.4（2C），124.1，122.9，121.2，120.2，112.5，99.5，42.2，32.6，20.7；HR-MSm/z：347.150 8 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-硝基苄基)乙酰胺（6h）：白色固体，收率40.4%。mp 195.2～197.9 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：12.00（d，J＝1.5 Hz，1H），9.03（t，J＝6.3 Hz，1H），8.21（d，J＝8.8 Hz，2H），8.14（d，J＝2.7 Hz，1H），8.07（d，J＝7.9 Hz，1H），7.58（d，J＝9.0 Hz，2H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H),7.27（ddd，J＝8.3、7.5、1.1 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.0、6.9、1.0 Hz，1H），4.48（d，J＝6.1 Hz，2H），4.04（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ166.0，162.3，159.8，147.2，146.5，136.4，128.3（2C），128.0，124.1，123.6（2C），122.9，121.2，120.2，112.5，99.6，42.0，32.5；HR-MSm/z：378.120 2 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(2-氟苄基)乙酰胺（6i）：白色固体，收率48.2%。mp 237.2～239.5 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.3 Hz，1H），8.88（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.9 Hz，1H），8.07（d，J＝7.7 Hz，1H），7.53（d，J＝8.0 Hz，1H），7.42～7.39（m，1H），7.35～7.32（m，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.7、1.3 Hz，1H），7.24～7.17（m，3H），4.37（d，J＝5.8 Hz，2H），4.00（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ165.7，162.2，160.13（d，J＝244.4 Hz），159.8，136.4，129.7（d，J＝4.4 Hz），129.1（d，J＝8.4 Hz），128.0，125.5（d，J＝15.0 Hz），124.4（d，J＝3.5 Hz），124.1，122.9，121.2，120.2，115.2（d，J＝21.1 Hz），112.5，99.5，36.4（d，J＝4.4 Hz），32.5；HR-MSm/z：351.125 7 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(3-氟苄基)乙酰胺（6j）：白色固体，收率48.3%。mp 239.2～241.5 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.91（t，J＝6.0 Hz，1H），8.12（d，J＝2.8 Hz，1H），8.07（d，J＝7.7 Hz，1H），7.53（d，J＝7.9 Hz，1H），7.40～7.36（m，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.6、1.2 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.4、7.1、1.1 Hz，1H），7.17～7.13（m，2H），7.11～7.07（m，1H），4.36（d，J＝6.0 Hz，2H），4.02（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.7，162.2，160.1（d，J＝244.4 Hz），159.8，136.4，129.7（d，J＝4.4 Hz），129.1（d，J＝8.4 Hz），128.0，125.5（d，J＝15.0 Hz），124.4（d，J＝3.5 Hz），124.1，122.9，121.2，120.2，115.2（d，J＝21.1 Hz），112.5，99.5，36.4（d，J＝4.4 Hz），32.5；HR-MSm/z：351.125 7 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氟苄基)乙酰胺（6k）：白色固体，收率51.5%。mp 229.6～231.0 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（d，J＝1.8 Hz，1H），8.88（t，J＝5.9 Hz，1H），8.12（d，J＝2.7 Hz，1H），8.07（d，J＝7.7 Hz，1H），7.53（d，J＝8.2 Hz，1H），7.37～7.33（m，2H），7.27（ddd，J＝7.4、6.8、1.3 Hz，1H），7.22（ddd，J＝8.4、7.3、1.2 Hz，1H），7.19～7.15（m，2H），4.32（d，J＝5.8 Hz，2H），3.32（s，2H）；13CNMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.6，162.2，161.3（d，J＝242.0 Hz），159.9，136.4，135.2（d，J＝3.2 Hz），129.3（d，J＝8.0 Hz），128.0，124.1，122.9，121.2，120.2，115.1（d，J＝21.0 Hz），112.5，99.5，41.8，32.5；HR-MSm/z：351.125 7 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-溴苄基)乙酰胺（6l）：白色固体，收率33.6%。mp 210.2～212.2 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.90（t，J＝6.2 Hz，1H），8.13（s，1H），8.07（d，J＝7.3 Hz，1H），7.52～7.54（m，3H），7.28～7.21（m，4H），4.31（d，J＝6.2 Hz，2H），4.00（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSOd6）δ：165.7，162.3，159.8，138.5，136.4，131.2（2C），129.6（2C），128.0，124.1，122.9，121.2，120.2，120.0，112.5，99.4，41.8，32.5；HR-MSm/z：411.045 7 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-硝基苄基)乙酰胺（6m）：白色固体，收率72.9%。mp 193.4～194.8 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.01（d，J＝1.9 Hz，1H），8.93（t，J＝5.8 Hz，1H），8.54（d，J＝1.5 Hz，1H），8.48（d，J＝8.5 Hz，1H），8.12（d，J＝9.0 Hz，1H），8.07（d，J＝7.8 Hz，1H），7.72（d，J＝7.8 Hz，1H），7.53（d，J＝7.8 Hz，1H），7.37（dd，J＝4.7、3.0 Hz，1H），7.27（ddd，J＝7.5、6.8、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.3、7.5、1.2 Hz，1H），4.37（d，J＝5.8 Hz，2H），4.00（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.8，162.3，159.8，148.8，148.3，136.4，135.2，134.5，128.0，124.1，123.5，122.9，121.2，120.2，112.5，99.4，40.2，32.5；HR-MSm/z：334.130 4 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(呋喃-2-基甲基)乙酰胺（6n）：白色固体，收率39.6%。mp 208.5～210.5 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：12.02（d，J＝1.9 Hz，1H），8.84（t，J＝5.5 Hz，1H），8.13（d，J＝2.8 Hz，1H），8.08（d，J＝7.7 Hz，1H），7.61（dd，J＝1.9 Hz，J＝0.8 Hz，1H），7.53（d，J＝8.0，1H），7.27（ddd，J＝7.7、6.7、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.5、7.3、1.2 Hz，1H），6.42（dd，J＝3.8、1.8 Hz，1H），6.31（dd，J＝3.2、0.6 Hz，1H），4.33（d，J＝5.6 Hz，2H），3.96（s，2H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：165.6，162.4，159.5，151.8，142.5，136.5，128.1，124.2，123.0，121.3，120.3，112.6，110.6，107.3，99.6，35.9，32.5；HR-MSm/z：323.114 4 [M＋H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-异丙基乙酰胺（6o）：白色固体，收率67%。mp 242.0～243.6 ℃；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.00（s，1H），8.26（d，J＝7.7 Hz，1H），8.12（d，J＝ 2.3 Hz，1H），8.08（d，J＝7.5 Hz，1H），7.53（d，J＝7.5 Hz，1H），7.26（ddd，J＝7.5、6.6、1.3 Hz，1H），7.23（ddd，J＝8.4、7.3、1.2 Hz，1H），3.88～3.83（m，3H），1.10（d，J＝6.6 Hz，6H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：164.4，163.2，160.0，136.4，127.9，124.1，122.8，121.1，120.2，112.5，99.5，55.0，40.9，32.6，22.3（2C）；HR-MSm/z：285.135 2[M＋H]+。

2.2 化合物的抗肿瘤活性研究

2.2.1 目标化合物对肿瘤细胞增殖的影响 采用MTT 法测试目标化合物6a～6o 对HeLa、SCG-7901和MDA-MB-231 细胞的体外抗肿瘤活性。将HeLa、SCG-7901、MDA-MB-231 细胞以5×104个/mL 密度接种到96 孔板中，每孔100 μL。在CO2培养箱中培养24 h。设置对照组和给药组，给药组每孔加入梯度稀释的化合物6a～6o 药液（终浓度分别为2.5、5、10、20、40 μmol/L）200 μL，对照组加入含有等体积DMSO 的培养基。培养48 h 后，加入5 mg/mL MTT 溶液5 μL，再继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 100 μL，震荡10 min，酶标仪测定490 nm 波长处的吸光度（A）值。实验设置3 个平行孔，重复2 次，取平均值。采用GraphPad Prism 9 计算目标化合物6a～6o 对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50），结果见表1。

表1 化合物6a～6o 的体外抗肿瘤活性Table 1 In vitro antitumor effect of compounds 6a — 6o

化合物6f、6g、6k、6l 表现出抗肿瘤活性，其中化合物6f、6g 对3 种肿瘤细胞均表现出良好的抗增殖作用。活性最好的化合物6f 对HeLa、SCG-7901和MDA-MB-231 细胞的IC50分别为（4.35±0.32）、（3.94±0.03）、（4.04±1.06）μmol/L。初步的构效关系研究表明，苄胺衍生物具有良好的抗肿瘤活性。其中苄胺的苯环上无取代基或为甲基取代基时，衍生物表现出明显的抗肿瘤活性。当苯环上的取代基替换为卤素或硝基取代时则活性下降，甚至消失，说明苄胺的苯环上连有供电子基团有助于抗肿瘤活性。当酰胺的氨基部分由苄胺替换为苯胺、烷基胺时，衍生物的抗肿瘤活性丧失。此外，将苄胺的苯基替换为吡啶或呋喃基团时，衍生物同样无明显抗肿瘤作用。说明苄胺基团对衍生物发挥抗肿瘤活性至关重要。

为了进一步考察目标化合物抗肿瘤作用是否具有选择性，实验测试了化合物6f、6g 对人胚肺成纤维细胞CCC-HPF-1 存活率的影响，结果见表1。结果显示，化合物6f、6g 的选择性指标[SI，SI＝IC50(CCC-HPF-1)/IC50(SGC-7901)]分别为 3.54、11.09，具有良好的细胞选择性。考虑到化合物6f 的活性更优，故选择化合物6f 进行后续实验。

2.2.2 化合物6f 抑制SCG-7901 细胞增殖 采用克隆形成实验考察化合物6f 对SCG-7901 细胞增殖的影响。实验设置空白组和给药组。取对数生长期的SCG-7901 细胞，调整细胞密度至800 个/mL，接种于6 孔板内，待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为10、20、40 μmol/L，空白组加入含等体积DMSO 的培养基。培养14 d后，弃去上清液，加入4%多聚甲醛固定细胞10 min，除去4%多聚甲醛。使用结晶紫染色液染色10 min，水洗除去多余的结晶紫染色液，晾干后进行拍照记录。用Image J 软件分析细胞集落数量（大于50 个细胞的细胞群为1 个集落），结果见图3。在40 μmol/L 的浓度下，化合物6f 可显著抑制细胞集落的形成，SCG-7901 细胞的平均集落数量由711 个（空白组）减少至2 个。

图3 化合物6f 对SCG-7901 细胞增殖的影响（,n＝3）Fig.3 Effect of compound 6f on colony formation of SCG-7901 cells ,n＝3)

2.2.3 化合物6f 诱导SCG-7901 细胞凋亡和坏死 采用Annexin V-APC/PI 双染法检测化合物6f 对SCG-7901 细胞凋亡和坏死的影响[14]。实验设置空白组和给药组。取对数生长期的SCG-7901 细胞，调整细胞密度至3×105个/mL，接种于6 孔板中，每孔1 mL。待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为10、20、40 μmol/L，空白组加入含等体积DMSO 的培养基。培养24 h 后，收集细胞，PBS 洗涤细胞，将细胞转移至流式管中，向流式管内分别加入Annexin V-APC（10 μL）和PI（5 μL）染液，室温孵育10 min，使用流式细胞仪检测凋亡和坏死细胞的比例。并使用Flow Jo 软件进行数据分析，数据显示为伪彩图，结果见图4。40 μmol/L 化合物6f 处理24 h 后，SCG-7901 细胞的早期凋亡细胞占比由4.76%升高到17.6%，晚期凋亡细胞占比由1.92%上升到13.2%。细胞凋亡率（早期凋亡与晚期凋亡）随浓度的升高而升高，呈一定的浓度相关性。提示化合物6f 通过促进肿瘤细胞的凋亡从而发挥抗肿瘤作用。

图4 化合物6f 对SCG-7901 细胞凋亡的影响（,n＝3）Fig.4 Effect of compound 6f on apoptosis rate of SCG-7901 cells ,n＝3)

2.2.4 化合物6f 对SCG-7901 细胞形态学的影响 采用DAPI 染色法检测化合物6f 对SCG-7901 细胞凋亡核染色质形态学的影响。实验设置空白组和给药组。取对数生长期SCG-7901 细胞，以4×104个/mL的细胞密度接种于置有直径为8 mm 爬片的48 孔板内，待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为5、10、20 μmol/L，空白组加入含等体积DMSO 的培养基。培养24 h，弃去上清，PBS 洗涤细胞，4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS 洗涤细胞3 次，取出爬片，置于含有DAPI 抗荧光淬灭封片液的载玻片上，4 ℃孵育15 min，使用荧光显微镜观察染色情况并拍照记录，结果见图5。空白组的细胞核形态规则，且呈弥散均匀的淡蓝色荧光。给予不同浓度的化合物6f 后，SCG-7901细胞的细胞核固缩，染色质高度凝聚，说明化合物6f 能够诱导SCG-7901 细胞的凋亡。

图5 化合物6f 对SCG-7901 细胞核形态变化的影响Fig.5 Effect of compound 6f on the nuclear morphological changes of SCG-7901 cells

2.2.5 化合物6f 诱导SCG-7901 细胞活性氧（ROS）水平升高 采用DCFH-DA 染色法检测化合物6f 对SCG-7901 细胞中ROS 含量的影响。实验设置空白组和给药组。取对数生长期的SCG-7901 细胞，以3×105个/mL 的细胞密度接种于24 孔板内。待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为5、10、20 μmol/L，空白组加入含等体积DMSO 的培养基。培养24 h，弃去上清液，加入DCFH-DA 荧光探针（10 μmol/L），室温避光孵育30 min，无血清培养基洗涤细胞3 次，使用荧光显微镜观察染色情况并拍照记录，结果见图6。与空白组相比，化合物6f 处理后的细胞内DCFH-DA的平均荧光强度明显增强，说明细胞内的ROS 水平显著升高，且具有剂量相关性。结果表明，化合物6f 可有效促进SCG-7901 细胞活性氧的生成。

图6 化合物6f 对SCG-7901 细胞内ROS 水平的影响Fig.6 Effect of compound 6f on ROS level of SCG-7901 cell

3 讨论

labradorin 1 是一种具有抗肿瘤活性的天然产物，实验在labradorin 1 的结构基础上采用骨架跃迁策略合成了一系列吲哚-1,3,4-二唑类衍生物，部分化合物表现出良好的抗肿瘤作用，其中化合物6f表现出最好的抗肿瘤活性，并具有一定的细胞选择性，说明酰胺的氨基部分为苄胺基团取代时活性最优。此外化合物6f 对所测试的3 种肿瘤细胞株均表现出抗增殖作用，说明化合物6f 还具有抗肿瘤谱广的特点。作用机制研究发现，该类衍生物可以诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死。其中衍生物诱导肿瘤细胞凋亡作用可能与促进肿瘤细胞内ROS 的产生，进而造成线粒体损伤有关[15-16]。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突