基于网络药理学和分子对接技术挖掘半贝丸治疗支气管炎的作用机制

成坤，王峰，刘源*，王子亮，李雪梅

1.商丘市第一人民医院 药学部，河南 商丘 476100

2.商丘市第一人民医院 呼吸科，河南 商丘 476100

支气管炎是呼吸道的常见疾病之一，由病毒和细菌反复感染、冷空气、烟雾、粉尘、空气污染、过敏等多种因素导致的以咳嗽、痰多、气促等症状及反复发作的慢性过程为特征的气管、支气管黏膜及其周围组织的炎症。支气管炎归属于中医“咳嗽”“哮喘”“痰饮”等范畴，中医认为肺主气，司呼吸，主宣发、肃降，通调水道，外合皮毛，开窍于鼻。肺气虚弱，外邪侵入致肺气不得正常宣降而咳嗽、气喘；脾虚运化失调，水湿痰饮停聚，痰饮上逆阻塞气道而喘促痰多；肾虚则气不归根，动则气促，命火不足水失其制，上泛为痰。中医治疗遵循“急则治其标、缓则治其本”的治疗原则，急性发作期以治标为主，缓解期则以调补肺、脾、肾3 脏而固本为主。半贝丸来源于《重订通俗伤寒论》，系止咳化痰、开郁散结剂，以咳嗽多痰为辨证要点。该方由半夏（制）和川贝母组方而成，味微苦，现收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第十三册，方中半夏为天南星科植物半夏的干燥块茎，性辛味温，归脾、胃、肺经，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的临床功效；川贝母性苦味甘，归肺、心经，清热润肺、化痰止咳、散结消痈。诸药合用，共奏止咳化痰、开郁散结之功，现代常用于治疗支气管炎、癫痫、淋巴结炎等病症。

中成药复方制剂具有多成分、多靶点、多通路整体作用的特点。网络药理学依托于系统生物学和网络理论[1-2]，在“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络的基础上，通过整合大量网络数据库资源，进行网络分析，从整体观系统地综合分析药物对疾病的干预和影响，与中医基础理论之整体观念相吻合。分子对接技术研究药物分子与蛋白靶点间的相互作用，预测其结合模式及亲合力，通过结合自由能验证筛选出的主要成分与关键靶点能否有效结合。本研究将上述2 种技术结合探讨半贝丸治疗支气管炎作用机制，并为半贝丸后续研究提供思路。

1 方法

1.1 半贝丸成分及靶点获取

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）获取半贝丸中半夏和川贝母所含化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18 筛选半贝丸的有效成分。并通过中国知网、万方、维普、PubMed 等数据库分别以“半夏”“Pinelliae Rhizoma”“川贝母”“Fritillariae CirrhosaeBulbus”为关键词，查找文献中有明确与治疗“支气管炎”“bronchitis”相关药理活性成分，建立活性成分数据库；同时运用TCMSP 数据库对其靶点蛋白进行预测。采用UniProt 蛋白质序列数据库将靶点蛋白名转换为靶点基因名。

1.2 半贝丸“成分-靶点”网络模型构建

利用Cytoscape 软件，按照半贝丸中活性成分预测的靶点，建立活性成分与靶点间的相互对应关系，构建“成分-靶点”网络模型。

1.3 支气管炎靶点获取

在GeneCards、OMIM 数据库中输入主题词“bronchitis”进行检索，同时对相关疾病靶点进行合并和去重，即得支气管炎疾病相关靶点，并把相关基因编码的蛋白质作为药物治疗的潜在作用靶点。

1.4 疾病-活性成分共同靶点的获取

将半贝丸成分靶点和支气管炎疾病靶点录入Bioinformatics &Evolutionary Genomics 在线软件作图工具平台，绘制韦恩图，获得疾病-活性成分共同靶点。

1.5 蛋白相互作用（PPI）网络的构建

在STRING 数据库在线平台（https://stringdb.org/）中，构建PPI 网络模型，获得PPI 网络图。

1.6 基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

在Metascape 数据库（https://metascape.org/）中录入交集靶点，进行生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）的GO 富集和KEGG 信号通路分析，并采用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）在线工具进行GO 富集分析弦图和KEGG富集分析气泡图，使其结果可视化。

1.7 分子对接验证

以PPI 网络模型中degree 值排名靠前的核心靶点为候选蛋白，在PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）中获得靶点蛋白PDB ID，以1.2 项下筛选出的半贝丸治疗支气管炎主要活性成分以及常用止咳化痰药盐酸氨溴索和氢溴酸右美沙芬为候选化合物，在PubChem 数据库获得活性成分3D 结构保存为mol2 格式，运用PyMOL 软件对蛋白质进行去水、加氢等操作，通过SwissDock 在线数据库进行分子对接。

2 结果

2.1 半贝丸活性成分筛选结果

共筛选出半夏潜在活性成分13 个，川贝母潜在活性成分13 个，其中半夏、川贝母共有活性成分1个；除上述成分外文献报道半夏中麻黄碱、伪麻黄碱[3-4]，川贝母中西贝母碱、贝母甲素对支气管炎均有明确的药理活性[5-6]，共获得29 个活性成分，见表1。通过TCMSP 数据库对上述成分进行靶点预测，29 个活性成分共获得靶点蛋白285 个，经标准化汇总去重，最终获得靶点基因95 个。

表1 半贝丸活性成分Table 1 Active ingredients of Banbei Pills

2.2 半贝丸活性成分及相应靶点的网络图

利用Cytoscape 3.7.1 软件将半贝丸的2 味中药、29 个活性成分和95 个相关靶点建立可视网络拓扑图，见图1。网络共包括126 个节点，295 条边。结果表明，β-谷固醇、黄芩素、麻黄碱、伪麻黄碱、豆甾醇、卡维丁、松柏苷等主要成分连接的靶点较多，直接或间接作用于前列腺素内过氧化物合酶 2（PTGS2）、PTGS1、肾上腺素能受体β2（ADRB2）、钠电压门控通道α 亚基5（SCN5A）、核受体共激活因子2（NCOA2）、雄激素受体（AR）、毒蕈碱型胆碱受体M3（CHRM3）、CHRM1 等主要靶点。

图1 半贝丸“成分-靶点”网络图Fig.1 “Ingredients-target” diagram of Banbei Pills

2.3 支气管炎疾病靶点

以“bronchitis”为关键词，在GeneCards、OMIM数据库中检索并筛选得到支气管炎相关的疾病靶点1 964 个。

2.4 疾病-活性成分共同靶点

将95 个活性成分靶点基因与1 964 个支气管炎靶点取交集，构建韦恩图，获得半贝丸治疗支气管炎的潜在作用靶点49 个，见图2。

图2 疾病-活性成分共同靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of common targets of diseases and active ingredients

2.5 PPI 网络构建

根据半贝丸治疗支气管炎的49 个潜在作用靶点，导入STRING 数据库在线平台中，获得PPI 网络，见图3。网络图中共有49 个节点，321 条边，平均节点数13.1，平均局部聚类系数0.661。以degree 值较高的靶点为核心基因，前9 位分别为蛋白激酶（Akt1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、肿瘤抑制因子P53（TP53）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、原癌基因c-Jun 产物（JUN）、基质金属蛋白酶-9（MMP9）、PTGS2、雌激素受体（ESR1）、细胞色素C（CYCS）。

图3 PPI 网络图Fig.3 PPI network diagram

2.6 GO 富集结果

把筛选得到的交集靶点输入到Metascape 数据库中，选定物种为人，点击个性化分析（custom analysis）进行GO 富集分析和KEGG 信号通路分析。GO 分析共得获得4 751 个富集结果（P＜0.01），其中BP3 890 项，主要涉及细胞对有机环状化合物的反应、对无机物的反应、对有毒物质反应、细胞对药物反应、凋亡信号通路、细胞对氮化合物反应、生殖结构发育、类固醇激素反应、离子传输调节、对氧气水平的反应等；CC 378 项，主要涉转录调节复合物、膜筏、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、突触后膜组成部分、细胞器外膜、枝晶膜、富含ficolin-1 颗粒内腔、分泌颗粒腔、细胞质核周区域、粘附连接；MF 483 项，主要涉及蛋白质结构域特异性结合、蛋白质同源二聚化活性、热休克蛋白结合、核受体活动、一氧化氮合酶调节活性、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡信号通路、组蛋白激酶活性、肽结合、支架蛋白结合、神经递质受体活性等。在BP、MF 和CC 中，以P值大小排序，分别选取排名前10 条目，采用微生信在线工具进行GO 富集分析弦图，使其结果可视化，见图4。

图4 GO 功能分析Fig.4 GO function analysis

2.7 KEGG 通路富集分析结果

通过Metascape 数据库进行KEGG 信号通路富集分析，得到380 条通道（P＜0.01），按富集基因数目排序后取前20 条信号通路，采用微生信在线工具进行KEGG 富集分析气泡图，使其结果可视化，见图5。前20 条KEGG 通路及其信息见表2。

图5 KEGG 通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis

表2 前20 条KEGG 通路关键靶点Table 2 Key targets of the top 20 KEGG pathways

2.8 分子对接验证

为验证活性成分与关键靶点的结合能力，将PPI 网络中degree 值较高的前4 个关键靶点Akt1、VEGFA、TP53、CASP3，与靶点连接最多的活性成分β-谷固醇、黄芩素、麻黄碱、伪麻黄碱和豆甾醇以及临床上治疗支气管炎常用的止咳化痰药盐酸氨溴索、氢溴酸右美沙芬进行分子对接验证，通过SwissDock 在线数据库获得分子对接结果，见表3。从分子对接结合能判断成分与相关潜在靶点的结合程度，结合能＜0 kcal/mol（1 cal＝4.2 J）表明分子与配体能够有效结合；结合能≤-7.0 kcal/mol 表明分子与靶点结合较紧密。从表3 结果可以看出β-谷固醇与Akt1、VEGFA、TP53、CASP3，黄芩素与Akt1、VEGFA、CASP3，豆甾醇与Akt1、VEGFA、TP53、CASP3 等结合较紧密，见图6。

图6 分子对接图Fig.6 Molecular docking diagram

表3 分子对接结果Table 3 Scores of molecular docking

3 讨论

本研究通过分析半贝丸“成分-靶点”网络，挖掘出半贝丸中关键化合物为β-谷固醇、黄芩素、麻黄碱、伪麻黄碱、豆甾醇、卡维丁、松柏苷等。β-谷甾醇对脂多糖诱导的急性肺损伤有较好的保护作用，可通过阻止肿瘤坏死因子、白细胞介素-6 的释放和下调核转录因子-κB 信号转导通路的活化等途径来发挥平喘的作用[7-8]；黄芩素具有抗病毒、抗菌、抗炎等作用，能够明显抑制铜绿假单胞菌的丛集运动和颤搐运动，破坏铜绿假单胞菌已形成的生物被膜，有效降低慢性支气管炎、弥漫性泛细支气管炎等肺疾病患者的感染几率。对呼吸道合胞病毒具有直接灭活作用，通过调节谷氨酰胺代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，有效抑制婴幼儿毛细支气管炎、支气管肺炎的发生[9-10]。黄芩素通过下调α-平滑肌肌动蛋白，抑制转化生长因子-β体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化过程[11]。麻黄碱和伪麻黄碱可以直接作用于α 和β 受体，能够直接或间接地发挥拟肾上腺素作用，松弛支气管平滑肌，抑制支气管平滑肌细胞增殖，舒张支气管，达到治疗咳嗽和支气管炎的作用[3,12-13]。豆甾醇抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降低胆固醇疗效显著[14]，可刺激网状内皮系统增生，加强巨噬细胞的能力，明显减少由脂多糖刺激增多的致炎因子环氧化酶-2 和诱生型一氧化氮合酶mRNA 的表达，同时通过减少前列腺素E2 和一氧化氮的释放发挥抗炎作用[15-16]。豆甾醇可显著抑制A7r5 细胞中血管紧张素Ⅱ诱导的活性氧的增加，增加血管紧张素Ⅱ处理的A7r5细胞中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，在A7r5 细胞中的抗氧化作用[16]。卡维丁具有较强的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除作用，其抗氧化活性显现浓度相关性，具有一定的抗炎活性[17]，现有文献报道对卡文定碱和松柏苷研究相对较少，但本研究显示这2 种成分能与较多靶点像连接，表明卡文定碱和松柏苷具有潜在治疗支气管炎活性，需要进一步深入研究。在半贝丸治疗支气管炎的过程中，以上化合物发挥了重要作用。

PPI 网络结果显示，半贝丸治疗支气管炎的关键靶点主要有Akt1、VEGFA、TP53、CASP3、JUN、MMP9、PTGS2、ESR1、CYCS 等。Akt1 参入代谢、增殖、细胞存活、生长等多种生物学过程，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信号通路中的关键节点[18]，对调节炎症反应具有重要作用[19]，直接影响肺部及气道炎症[20]。VEGFA 是一种高度保守的二聚体糖蛋白，通过影响毛细血管后静脉和小静脉增加血管通透性，主要由肺血管内皮细胞和上皮细胞合成分泌，可促进血管内皮增生，具有抗内皮细胞凋亡作用，是血管生成的重要调节因子，受炎症因子、缺氧诱导因子-1α 等调节，通过增加超氧化物歧化酶的表达产生抗氧化保护作用，对肺脏的生长发育、维持生理功能、修复损伤具有重要意义，与慢性炎症性气道疾病相关[21]。TP53 可调控细胞凋亡、细胞周期阻滞，其协同p300 基因抑制核因子κB、Toll 样受体4 和泛素连接酶TRAF6 的活化，负调控肿瘤坏死因子α 等炎症因子的分泌[22]。CASP3 是细胞凋亡的关键效应因子，对机体受损伤的细胞予以清除从而维持自身稳定[23-26]，CASP3 的表达与肺水肿以及肺组织中细胞凋亡呈正相关，与肺功能呈负相关，药物对肺组织中CASP3 干预后，CASP3 表达减少，可有效减轻细胞凋亡，进而改善肺功能[27]。原癌基因C-jun 产物Jun 与原癌基因c-fos 产物Fos 结合形成异二聚体AP-1 或多聚体型反式因子，组成AP-1 转录因子，在转录水平调节下游靶基因的表达，直接调控炎性蛋白的合成，调控平滑肌细胞的活化和增殖[28-29]。MMP9 是高度保守的钙锌离子依耐性内切酶超家族之一，能调节其他蛋白酶及细胞因子活性，通过释放血管内皮生长因子参与血管生成，分解呼吸道和肺内结构复合物，参与呼吸道和肺的重建[30]。MMP9 水平与气道炎症炎性细胞的数量呈正相关，MMP9 增加可导致气道损伤，促进血管生成、成纤维细胞增生和气道重塑[31]。综上所述，半贝丸可能通过调节上述关键靶点的表达，从而发挥治疗支气管炎的作用。

通过Metascape 数据库进行KEGG 信号通路富集分析发现，半贝丸治疗支气管炎的核心靶点涉及癌症信号通路、小细胞肺癌等通路。其中PI3K/Akt信号通路在炎症、肿瘤、代谢等相关疾病的发病机制研究中具有重要意义[32]；激活PI3K/Akt 信号通路可促进呼吸道上皮细胞炎症反应[33]；细胞凋亡是细胞基因控制的细胞自主有序死亡[18]，气道上皮细胞过度凋亡，其完整性被破坏，导致气道局部微环境稳态被破坏[33]；晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）信号通路可激活核因子-κB 信号通路，引起多种黏附因子、趋化因子、生长因子、炎症因子的释放，产生更多炎症介质，造成气道高反应和组织损伤等[34-35]。

本研究采用网络药理学探讨了半贝丸治疗支气管炎的作用机制，分析出半贝丸的主要成分可能是β-谷固醇、黄芩素、麻黄碱、伪麻黄碱、豆甾醇、卡维丁、松柏苷等，作用靶点可能是Akt1、VEGFA、TP53、CASP3、JUN、MMP9，其作用通路可能是PI3K/Akt 信号通路、细胞凋亡、AGE-RAGE 信号通路。后续研究可以在此基础上对筛选出的关键靶点和通路加以验证，为半贝丸的临床治疗提供指导。

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