大蒜素微乳剂高效液相色谱分析方法研究

王玉萍，付萍萍，蒲 时，姜军侠

（陕西省农业检验检测中心，陕西 西安 710003）

1 前言

大蒜素是以大蒜为原料提取的产品，也可化工合成，是一种具有刺激性气味的有机硫化合物，化学名为二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚，是大蒜中主要的杀菌成分［1-2］。目前作为饲料添加剂使用的大蒜素绝大部分是化工合成的产物。农业上用作杀虫、杀菌剂，也用于饲料、食品、医药上［3］。

对于在农业种植方面，也有大量研究表明大蒜素对于大部分植物的细菌性病害都具有较好的防治效果，同时对于真菌病害也具有一定的防效。根据研究报道科学使用大蒜素防治辣椒炭疽病，防效可与多菌灵相当，达到80%左右。在国外已经有不少大蒜素登记的农药，广泛应用于果树、蔬菜、鲜花等作物上防治病害和虫害。在农药残留方面，大蒜素是一种天然植物源农药，与人类日常饮食密切相关；施药量低，植物中残留量远低于人体每日从大蒜中摄取量，在自然环境中易降解，国内外未对大蒜素最大残留限量做出规定，在我国对其使用安全性高度认可，且至今未发现有大蒜素在作物上超标而引起人体危害的情况。

2 试验部分

2.1 试剂和溶液 甲醇：色谱纯；乙腈：色谱纯；水：新蒸二次蒸馏水或超纯水；二烯丙基二硫醚标样：已知质量分数，ω≥89.0%；二烯丙基三硫醚标样：已知质量分数，ω≥90.9%；（ChromaDex）；5%大蒜素微乳剂。

2.2 仪器 高效液相色谱仪：Agilent 1260，具有二极管阵列检测器和自动进样器；Agilent 色谱工作站；色谱柱：150 mm×4.6 mm（i.d.）不锈钢柱，内装ZORBAX SB-C18、5µm填充物。

2.3 液相色谱操作条件 流动相：Ψ（乙腈∶水）＝60∶40，经滤膜过滤，并进行脱气；流量：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：230 nm；进样体积：5µL；保留时间：二烯丙基二硫醚约7.6 min；二烯丙基三硫醚约12.2 min。典型的大蒜素的标样、样品色谱图（图1、2、3）。

图1 二硫醚标样色谱图

图2 三硫醚标样色谱图

图3 大蒜素5%微乳剂试样液相色谱图

2.4 测定步骤

2.4.1 标样溶液的配制 分别称取0.05 g（精确至0.000 1 g）二硫醚和三硫醚标样于2 个100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声波振荡5 min，冷却至室温。

2.4.2 试样溶液的配制 称取含0.05 g（精确至0.000 1 g）大蒜素的试样于100 mL 容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度并摇匀，超声波振荡5 min，冷却至室温，过滤。

2.4.3 测定 在上述操作条件下，在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2 针二硫醚或三硫醚峰面积相对变化＜1.2%时，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

2.4.4 计算 将测得的2 针试样溶液以及试样前后2 针标样溶液中二硫醚或三硫醚峰面积分别进行平均。试样中二硫醚或三硫醚的质量分数按式（1）计算，两者质量分数之和即为大蒜素质量分数：

式中：

ω1——试样中二硫醚或三硫醚的质量分数，%；

A2——试样溶液中二硫醚或三硫醚峰面积的平均值；

m1——标样的质量的数值，g；

ω——标样中二硫醚或三硫醚的质量分数，%；

A1——标样溶液中二硫醚或三硫醚峰面积的平均值；

m2——试样的质量的数值，g。

3 结果分析

3.1 色谱条件选择 色谱柱选择常用的ZORBAX SB-C18反相柱。根据大蒜素物化性质、溶剂的紫外吸收波长和成都新朝阳作物科学有限公司的企业标准，选择甲醇作为溶剂溶解样品，并以乙腈和水作为流动相。为了得到更好的分离效果和峰形，将流动相按不同比例在色谱柱上进行试验，当Ψ（乙腈∶水）=60∶40 作为流动相，流速1.0 mL/min，该条件下，二硫醚和三硫醚色谱峰峰形较好，峰纯度＞990，与杂质能完全分离，具有良好的精密度和准确度，并且分析时间较短，提高了工作效率。

3.2 检测波长的选择 通过Agilent 1260 高效液相色谱仪的光谱数据采集功能，二硫醚、三硫醚的紫外光谱图（图4、5），从图中可以看到二硫醚和三硫醚的最大吸收波长均约为190 nm，190 nm属于低波长段，灵敏度虽高，但干扰较大，故选择230 nm 作为检测波长，灵敏度较好，且干扰小，能满足分析要求。

图4 二硫醚的紫外光谱图

图5 三硫醚的紫外光谱图

3.3 分析方法的线性相关性试验 按2.4.1 标样溶液的制备方法配制5 个不同浓度的有效成分线性相关溶液，分别标记为STD1 至STD5。在上述操作条件下，待仪器稳定后，按照STD1 至STD5 的顺序测定每个溶液中二硫醚或三硫醚的峰面积，取2 次测定的平均结果。以二硫醚或三硫醚质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果（表1、2）、（图6、7）。

表1 二硫醚线性范围的测定

表2 三硫醚线性范围的测定

图6 二硫醚峰面积与质量浓度关系图

图7 三硫醚峰面积与质量浓度关系图

从表1～2和图6～7可以看出，当二硫醚质量浓度在280.4～654.2 mg/L 之间（进样体积5µL），三硫醚质量浓度在128.2～542.5 mg/L 之间（进样体积5 µL），与相应的峰面积之间呈现良好的线性关系，计算得回归方程为y二硫醚=7.330 3x+99.808、y三硫醚=14.113x-204.16，相关系数r二硫醚=0.999 9、r三硫醚=0.996 1 完全可以满足定量分析要求。本方法中二硫醚和三硫醚标样质量浓度分别为467.3、339.1 mg/L（进样体积5µL）。

3.4 分析方法的精密度试验 按2.4.2 试样溶液的制备方法配制5 个5%大蒜素微乳剂精密度溶液，以有效成分线性相关溶液STD3 为标样溶液，在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标样溶液、精密度溶液、精密度溶液、标样溶液的顺序进行测定，结果（表3）。

表3 分析方法的精密度试验结果

3.5 分析方法的准确度试验 称取含0.025 g（精确至0.000 1 g）大蒜素的5%大蒜素微乳剂于100 mL 容量瓶中，再分别加入二硫醚的标样0.025 g 和三硫醚标样0.015 g，按2.4.2 试样溶液的制备方法配制5 个有效成分准确度溶液，以线性相关溶液STD3 为标样溶液，在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标样溶液、准确度溶液、准确度溶液、标样溶液的顺序进行测定，结果（表4）。

表4 分析方法的准确度试验结果

3.6 方法特异性 本试验采用HPLC-DAD 峰纯度分析法来鉴别大蒜素。大蒜素标样、5%大蒜素微乳剂的大蒜素HPLC-DAD 峰纯度均＞990，有效成分处无其它物质干扰，符合定量分析要求。峰纯度色谱图（图8～11）。

图8 二硫醚标样HPLC-DAD峰纯度色谱图

图9 三硫醚标样HPLC-DAD峰纯度色谱图

图10 5%大蒜素微乳剂中二硫醚HPLC-DAD峰纯度色谱图

图11 5%大蒜素微乳剂中三硫醚HPLC-DAD峰纯度色谱图

4 结论

本文建立了检测大蒜素微乳剂中有效成分质量分数的高效液相色谱分析方法。试验结果表明，大蒜素在测试浓度范围内线性关系良好，有较高的准确度和精密度，具有分离效果好，分析时间短，操作简便等特点，符合定量分析要求，是一种高效、快速、准确的分析方法。