从“扶正祛邪”角度探讨升阳益胃汤加减方治疗溃疡性结肠炎大鼠的效应机制※

吕小燕,张瑜,尚可,杜慧娟,冯五金

（山西省中医药研究院,山西 太原 030024）

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)因腹痛、黏液脓血便等症状反复发作被世界卫生组织列为现代难治性疾病之一,其发病机制与在肠黏膜屏障受损基础上的肠道免疫失衡有关[1]。目前西医治疗UC的关注点仍以5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂等逐渐升阶梯的祛邪抗炎治疗方案为主,忽略修复损伤肠黏膜屏障功能的重要性。结合目前临床治疗中患者存在病情反复、疗效不稳定、潜在感染等正气亏虚的特征,笔者认为可从中医“扶正祛邪”角度出发治疗UC,修复损伤的肠黏膜屏障,调节菌群失调状态等,以恢复UC患者的肠道免疫平衡。

升阳益胃汤加减方是在李东垣升阳益胃汤益气健脾、祛湿的基础上,结合UC久病及肾,久病入络、多瘀等病机特点,加仙茅、淫羊藿、丹参、秦皮、厚朴等补肾活血、燥湿止痢中药组成,具有益气健脾、祛湿止痢、扶正祛邪的功效。本研究从中医“扶正祛邪”角度观察升阳益胃汤加减方对UC大鼠肠黏膜屏障蛋白闭锁小带蛋白1(ZO-1)、occludin及炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响。

1 材料

1.1 药物与试剂 ①升阳益胃汤加减方煎剂组成:黄芪30 g,半夏9 g,党参片15 g,炙甘草5 g,羌活、独活、防风、炒白芍各15 g,麸炒白术30 g,陈皮15 g,茯苓30 g,柴胡9 g,泽泻15 g,黄连片3 g,仙茅9 g,淫羊藿9 g,厚朴15 g,秦皮15 g,丹参15 g。由山西省中医药研究院东山科教院区实验室提供并熬制成水煎剂,按标准成人剂量与大鼠转换系数6.25,计算大鼠的给药剂量,含生药量为31.73 g/kg。②美沙拉秦肠溶片(Losan Pharma Gmb H,国药准字H20171358,0.5 g/袋),含药量为0.34 g/kg,至研磨机中研磨成细微粉末,加100°C 蒸馏水制成混悬液,现用现配。③IL-6抗体(批号:GR3337471-16)、occludin 抗体(批号:GR3452603-3)、TNF-α 抗体(批号:GR3405981-5)、ZO-1抗体(批号:GR3354270-17)均购自Abcam 公司。④葡聚糖硫酸钠(DSS)(上海麦克林生化科技有限公司,批号:C12469988)。⑤10%水合氯醛溶液、中性福尔马林溶液由山西省中医药研究院东山科教院区实验室提供。⑥Contour Elite三维光学显微镜购有美国布鲁克公司。

1.2 实验动物与分组 SPF级SD大鼠40只,雌雄各半,体质量190～210 g,由山西省中医药研究院东山科教院区实验室提供(实验动物合格证号:110324210102969274,伦理编号:SZYLY2021KY-0329)。40只SD大鼠适应性喂养1周后标号、称重,随机均分为模型组、正常组、中药组和西药组,每组10只。

2 方法

2.1 模型制备及给药方法 模型组、中药及西药组大鼠经适应性喂养1周后,采用葡聚糖硫酸钠盐(DSS)诱导建立UC大鼠模型:上午按1 m L/100 g体质量予5%DSS溶液灌胃,同时予5%DSS溶液自由饮,连续7 d建立UC大鼠模型(根据预实验结果,随机抽取5只大鼠,予上述方法造模,7 d后处死2只大鼠,观察结肠黏膜组织充血、水肿、溃疡等情况,确定造模成功)。中药组大鼠每日下午按1 m L/100 g体质量给予升阳益胃汤加减方煎剂灌胃,西药组给予美沙拉秦肠溶片粉末溶液灌胃,正常组大鼠按1 m L/100 g给予纯净水灌胃及自由饮,各组大鼠连续灌胃7 d。

2.2 结肠组织形态学观察 实验期满后,各组大鼠禁食不禁水12 h,后用10%水合氯醛按0.35 m L/100 g行腹腔注射麻醉后,取出结肠,纵向切开肠腔,用生理盐水冲洗肠道内容物,肉眼观察其结肠黏膜变化,然后采用中性福尔马林固定,继续予以水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋,冰冻切片机做连续冠状切片,片厚50μm,取部分切片进行苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察结肠黏膜组织细胞的病理改变,按表1进行评分。

表1 光镜下病理形态评定表

2.3 ZO-1、occludin及IL-6、TNF-α指标测定 在室温下取出冰冻石蜡切片,进行脱蜡水合,采用枸橼酸溶液进行抗原修复;H2O2孵育后,加入山羊血清封闭,清洗后加入按说明书比例稀释的IL-6、occludin、TNF-α、ZO-1一抗,4 ℃孵育;次日加入二抗,室温孵育,采用DAB法显色,再进行冲洗,苏木精复染,封片,在显微镜下观察不同部位ZO-1、Occludin、IL-6、TNF-α表达情况并摄片。参照《免疫组织化学检测技术共识》中评分标准对各指标进行评分,根据阳性细胞染色程度及着色细胞百分率进行计分:0分为不着色,1分为浅棕色,2分为深棕色;着色细胞＜5%计0分,5%～25%计1分,26%～50%计2分,＞50%计3分。两个分值相加,0～1分为(-),2分为弱阳性(+),3分为阳性(++),4～6分为强阳性(+++)[2]。

2.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件分析数据。等级资料采用秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般状态观察 正常组大鼠大便成形、色黄,皮毛浓密、光洁,体态正常,食欲可,体质量逐日增加。模型组大鼠在造模第4日出现少许黏液便;造模第6日食欲减退,进食量减少,后逐渐出现精神不振、乏力、喜静少动、悬空拉尾抗力减弱、自发活动数降低、皮毛粗糙;造模第16日出现血便。西药及中药组大鼠状态较正常组稍差,较模型组好。造模结束后,模型组有1只大鼠死亡,西药组有1只大鼠死亡,中药组有2只大鼠死亡,正常组均存活。

3.2 对结肠组织形态的影响 正常组结肠黏膜上皮组织整齐,细胞排列密集,可见杯状隐窝,无炎症细胞浸润,未见糜烂、溃疡。模型组结肠黏膜上皮缺损,基本无结构完整的隐窝,黏膜及黏膜下层见大量炎症细胞浸润。中药组结肠黏膜上皮部分中断,与模型组相比缺损面积小,部分隐窝结构破坏,可见少许炎症细胞浸润。西药组结肠黏膜组织变化接近中药组。见图1(见本期第129页)。

图1 4组大鼠结肠黏膜病理苏木精-伊红染色图片比较(×100)

3.3 对结肠组织病理评分的影响 与正常组相比,模型组病理学评分显著升高(P＜0.01);与模型组相比,中药、西药组病理评分均显著下降(P＜0.01)。见表2。

表2 4组大鼠结肠组织病理评分比较

3.4 对occludin、ZO-1蛋白表达的影响 与正常组相比,模型组肠黏膜屏障蛋白occludin、ZO-1表达显著下降;与模型组相比,中药、西药组肠黏膜屏障蛋白occludin、ZO-1表达增加,但低于正常组,差异均有统计学意义(P＜0.01)。见图2、3(见本期第129页)及表3。

图2 4组大鼠结肠黏膜蛋白occludin的表达(×100)

图3 4组大鼠结肠黏膜蛋白闭锁小带蛋白1的表达(×100)

表3 4组大鼠结肠黏膜屏障蛋白occludin、闭锁小带蛋白1表达水平比较

3.5 对TNF-α、IL-6表达的影响 与正常组相比,模型组大鼠肠黏膜炎症因子TNF-α、IL-6表达均显著增加;与模型组相比,中药、西药组大鼠肠黏膜TNF-α、IL-6表达均降低,差异均有统计学意义(P＜0.01)。见图4、5(见本期第129页)及表4。

图4 4组大鼠结肠黏膜肿瘤坏死因子α的表达(×100)

图5 4组大鼠结肠黏膜白细胞介素-6的表达(×100)

表4 4组大鼠结肠黏膜白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α表达比较

4 讨论

UC是一种侵及结肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎性疾病,以反复发作的腹泻、黏液脓血便,伴腹痛、里急后重为主要临床表现。目前西医治疗UC 以美沙拉秦制剂抗炎为主,虽短期疗效较好,但存在肝肾功能损害、病情反复等弊端[3]。在患者对美沙拉嗪制剂治疗不应答或病情加重、反复等情况下,采用激素、生物制剂等治疗,虽能取得一定的治疗效果,但有疗效不稳定、发生感染、免疫抑制等问题[4-6]。UC 的发病机制目前虽尚未阐明,但近年研究表明遗传、环境、心理、感染等多重致病因素致肠黏膜免疫失衡是该病发生的主要病理机制,在肠黏膜免疫失衡的病理基础上,肠黏膜屏障受损致肠上皮细胞间通透性增加是启动UC、主导UC进展的重要因素[7]。扶正祛邪修复损伤的肠黏膜屏障,恢复肠道免疫平衡是UC治疗的重点。

occludin及ZO-1蛋白是肠黏膜屏障的重要组成部分,分属于肠黏膜屏障紧密连接跨膜蛋白和连接跨膜蛋白及细胞骨架间的连接复合物蛋白,是肠黏膜屏障功能受损的重要检测指标。研究表明,UC患者受损的肠黏膜屏障致肠上皮细胞间通透性增加,可使细菌、病毒等进入肠黏膜,激活以TNF-α为主的肠黏膜炎性反应,TNF-α进一步刺激单核巨噬细胞和中性粒细胞,合成IL-6,进一步加重肠黏膜组织损伤,形成结肠黏膜及黏膜下层持续性或间断性炎症[8]。

溃疡性结肠炎属于中医“久痢”“肠澼”等范畴。《溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见(2017年)》指出脾气亏虚是UC 发生的基本病机[9]。在脾虚基础上,湿、热、瘀等病理因素互结致“内疡”是UC发病的主要病机。升阳益胃汤加减方是在李东垣升阳益胃汤益气健脾、祛湿的基础上,结合“脾病及肾、湿困脾土”的中医理论及UC久病入络、多瘀的病机特点,加仙茅、淫羊藿、丹参、秦皮、厚朴,具有益气健脾、活血祛湿解毒的功效,符合中医扶正祛邪的组方特点。本研究结果表明,升阳益胃汤加减方可显著降低UC 大鼠肠黏膜TNF-α、IL-6表达,升高肠黏膜屏障蛋白occludin、ZO-1表达,表明修复损伤的肠黏膜屏障、祛湿消滞、扶正祛邪可能是该方治疗UC的主要效应机制。本研究为中医药防治UC的效应机制提供了研究依据。