杨藏军
(河北冀衡药业股份有限公司,河北 衡水 053400)
亚叶酸钙又名5- 甲酰基四氢叶酸钙,别名安曲希,是一种类白色至微黄色结晶或无定形粉末;在水中溶解,在乙醇和乙醚中几乎不溶。在医药工业中应用较为广泛。作为四氢叶酸的甲酰衍生物,亚叶酸钙与氟尿嘧啶联合应用能够抑制DNA 的合成,从而发挥抗肿瘤作用;用作叶酸拮抗剂(如甲氨蝶呤、乙胺嘧啶或甲氧苄啶等) 的解毒剂;用于预防甲氨蝶呤过量或大剂量治疗后所引起的严重毒性作用;此外还可用于由叶酸缺乏引起的巨幼红细胞性贫血。
传统的亚叶酸钙制备工艺是将叶酸溶解于碱性溶液中,以硝酸铅作为催化剂进行还原,所得还原产物经甲酰化反应成环后酸化得到甲酰四氢叶酸盐酸盐,最后再与水溶性钙盐水解反应得到亚叶酸钙。整个制备过程均用二巯基乙醇作为抗氧化保护剂。此方法中所用硝酸铅催化剂、二巯基乙醇抗氧化保护剂均具有毒性,若在亚叶酸钙中残存,将带来质量安全隐患。
针对传统亚叶酸钙制备合成工艺存在的缺点,对其合成工艺路线进行优化。以叶酸为原料,硼氢化钠作为催化剂进行还原得到四氢叶酸,再经过甲酰化环合酸化成盐,最后在钙盐中水解成盐得到亚叶酸钙。
该工艺合成亚叶酸钙,起始原料及试剂易得,质量稳定可靠,合成过程中毒性小,安全性能好,“三废”处理简单,适合工业化生产。
UltiMate 3000 型高效液相色谱(赛默飞世尔科技(中国) 有限公司),默克密理博Milli-Q IQ 7000 水纯化机(密理博中国有限公司),BSA224S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京) 有限公司),KQ-250DB 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),DF-101T 型集热式恒温加热磁力搅拌器(上海耀裕仪器设备有限公司)、电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)、循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
叶酸(河北冀衡药业股份有限公司);硼氢化钠(天津市大茂化学试剂厂);氢氧化钠(天津市大茂化学试剂厂);甲酸(天津市大茂化学试剂厂)三氟乙酸(天津市大茂化学试剂厂);氯化钙(天津市大茂化学试剂厂),以上试剂均为分析纯。
2.1.1 叶酸还原为四氢叶酸方程式
叶酸还原为四氢叶酸方程式如图1 所示。
图1 四氢叶酸合成方程式Fig.1 Tetrahydrofolate synthesis by Eq
2.1.2 影响反应的因素
本实验主要考察了还原剂用量、反应时间、淬灭温度等因素对四氢叶酸纯度的影响,通过单因素实验,得到较优的四氢叶酸生产工艺条件。
(1) 还原剂用量对四氢叶酸纯度的影响。
将18 g30%NaOH,30 g 叶酸,100 g 的纯化水加入500 mL 四口瓶中,加热到60℃,使叶酸溶解,将不同用量的NaBH4加入到50 g 水中溶解,缓慢滴加到叶酸溶液中,温度控制在60 ~65 ℃。滴加完NaBH4,温度升至90 ℃,反应2 h,考察不同硼氢化钠用量对四氢叶酸纯度的影响,实验结果见表1。
表1 硼氢化钠用量对四氢叶酸纯度影响Table 1 Effect of the dosage of sodium borohydride on the purity of tetrahydrofolate
硼氢化钠用量较少时,叶酸反应不完全,硼氢化钠用量较多时,叶酸反应完全,但副产也增多,四氢叶酸纯度不高,所以最佳质量比为叶酸∶硼氢化钠=1∶0.8。
(2) 反应时间对四氢叶酸纯度的影响。
将18 g 30%NaOH,30 g 叶酸,100 g 的纯化水加入500 mL 四口瓶中,加热到60 ℃,使叶酸溶解,将24 g NaBH4加入到50 g 水中溶解,缓慢滴加到叶酸溶液中,温度控制在60 ~65 ℃。滴加完NaBH4,温度升至90 ℃,反应2、3、4 h,考察不同反应时间对四氢叶酸纯度的影响。实验结果见表2。
表2 反应时间对四氢叶酸纯度影响Table 2 Effect of reaction time on the purity of tetrahydrofolate
由表2 可得,随着反应时间的增长,四氢叶酸的纯度下降,杂质增多,这是因为四氢叶酸不稳定,在高温条件下易被氧化或降解生成蝶呤类杂质及对氨基苯甲酰谷氨酸。因此,高温还原时间最佳为2 h。
(3) 淬灭温度对四氢叶酸纯度的影响。
将18 g 30%NaOH,30 g 叶酸,100 g 的纯化水加入500 mL 四口瓶中,加热到60 ℃,使叶酸溶解,将24 g NaBH4加入到50 g 水中溶解,缓慢滴加到叶酸溶液中,温度控制在60 ~65 ℃。滴加完NaBH4,冷却降不同温度,滴加浓盐酸调节pH 值为3 ~4,考察四氢叶酸纯度,实验结果见表3。
表3 淬灭温度对四氢叶酸纯度的影响Table 3 Effect of the quenching temperature on the purity of tetrahydrofolate
不同的淬灭温度对四氢叶酸影响较大,是因为四氢叶酸不稳定,温度较高时,极易变色变质,查阅资料,四氢叶酸于-20 ℃储存,所以,调节pH值时,必须在低温下(0~5 ℃) 进行,以保证四氢叶酸的稳定性。
2.1.3 还原反应小结
将18 g 30%NaOH,30 g 叶酸,100 g 的纯化水加入1 000 mL 四口瓶中,加热到60 ℃,使叶酸溶解,将24 g 的NaBH4加入到50 g 水中溶解,缓慢滴加到叶酸溶液中,温度控制在60 ~65 ℃。滴加完NaBH4,温度升至90 ℃,反应2 h,降温至0 ~5 ℃,用浓盐酸调pH 值为3 ~4,析出四氢叶酸晶体,搅拌0.5 h,抽滤,得四氢叶酸湿品,将四氢叶酸湿品放入冰箱-18 ℃保存备用。
2.2.1 四氢叶酸甲酰化成盐为5,10- 亚甲基四氢叶酸盐酸盐反应方程式
5,10- 亚甲基四氢叶酸盐酸盐合成方程式如图2 所示。
图2 5,10- 亚甲基四氢叶酸盐酸盐合成方程式Fig.2 An equation for the synthesis of 5,10-methylene tetrahydrofolate hydrochloride
2.2.2 影响反应的因素
第二步甲酰化反应主要考察了反应温度对5,10- 亚甲基四氢叶酸盐酸盐纯度的影响。
(1) 反应温度对甲酰化反应的影响
向四口瓶中加入四氢叶酸,甲酸,三氟乙酸,开启搅拌和加热,于不同温度下反应6 h,取样进行液相分析,实验结果见表4。
表4 反应温度对5,10- 亚甲基四氢叶酸纯度的影响Table 4 Effects of reaction temperature on the purity of 5,10-methylene tetrahydrofolate
由表4 可见,四氢叶酸甲酰化反应随着温度的升高,5,10- 亚甲基四氢叶酸纯度有所下降,副反应增加。所以该反应最佳反应温度为30 ℃。
2.2.3 甲酰化成盐反应工艺总结
四氢叶酸甲酰化成盐为5,10- 亚甲基四氢叶酸盐酸盐最佳工艺条件为四氢叶酸、甲酸与三氟乙酸、浓盐酸按1∶3.75∶0.375∶3.75 的质量比进行投料。将第一步所得四氢叶酸投至四口瓶中,依次加入甲酸、三氟乙酸搅拌溶解后升温至30 ℃,恒温反应6 h,反应完毕,减压蒸除甲酸,将所得浓缩液投至四口瓶中,加入浓盐酸在室温下搅拌2 h成盐,抽滤得5,10- 亚甲基四氢叶酸盐酸盐。
2.3.1 5,10- 亚甲基四氢叶酸盐酸盐水解成盐合成亚叶酸钙反应方程式
亚叶酸钙合成方程式如图3 所示。
图3 亚叶酸钙合成方程式Fig.3 The leucovorin calcium synthesis equation
2.3.2 影响反应的因素
水解反应考察了水解pH 值、水解温度、水解时间3 个因素对亚叶酸钙纯度的影响。
(1) 水解液pH 值对亚叶酸纯度的影响。
开环步骤中,由于5,10- 亚甲基四氢叶酸在碱性条件下易生成10- 甲酰四氢叶酸(动力学控制的过程),在生产规模下以强碱溶液调节开环体系的pH 值,极易造成局部pH 值过高,生成10 位甲酰化的副产物,由于该类杂质溶解度低于亚叶酸钙,拆分过程常常随着析出主产物一起析出,难以去除,实验结果见表5。
表5 水解pH 值对亚叶酸纯度的影响Table 5 Effect of hydrolysis of pH vaule on leucovorin purity
由表5 可得,水解过程必须严格控制水解液pH 值为6 ~7,若水解液碱性增大为pH 值为9 ~10,那么开环反应生成的10- 甲酰基四氢叶酸杂质较多。
(2) 水解温度对亚叶酸纯度的影响。
水解pH 值保持在6~7 之间不变,水解时间为3、4 h,考察水解温度为70、80、90、100 ℃对亚叶酸纯度的影响,实验结果见表6。
表6 水解温度对亚叶酸纯度的影响Table 6 Effect of the hydrolysis temperature on the purity of leucovorate
由表6 可得,5,10- 亚甲基四氢叶酸水解成亚叶酸的最佳水解温度为100 ℃,此时亚叶酸的纯度最高。
(3) 水解时间对亚叶酸纯度的影响。
水解液pH 值保持在6 ~7 之间不变,水解温度为100 ℃,考察水解时间为1、2、3、4、6、7 h对亚叶酸纯度的影响,实验结果见表7。
表7 水解时间对亚叶酸纯度的影响Table 7 Effects of hydrolysis time on the purity of leucovorate
由表7 可见,反应刚开始,随着水解时间的增长,5,10- 亚甲基四氢叶酸水解为亚叶酸的纯度越高,但超过6 h,继续水解时间的增长,亚叶酸的纯度反而下降,可能是亚叶酸高温下不稳定,氧化所致,所以最佳水解时间为6 h。
2.3.3 水解成盐工艺总结
5,10- 亚甲基四氢叶酸盐酸盐水解成盐最佳工艺条件为5,10- 亚甲基四氢叶酸盐酸盐、活性炭、无水氯化钙、无水乙醇按质量比1∶0.05∶0.275∶2 进行投料。具体如下:将5,10 亚甲基四氢叶酸盐酸盐投入四口瓶中,用30%氢氧化钠溶液,调pH=6 ~7,100 ℃水解6 h,加入定量活性炭脱色30 min,过滤,所得滤液降温至30 ℃,加入氯化钙反应1 h,过滤,滤液加入定量乙醇析出晶体,搅拌0.5 h,降温至5 ℃,离心得湿品。30 ℃真空干燥5 h,得亚叶酸钙。
以叶酸为起始原料,经硼氢化钠还原得四氢叶酸,以甲酸、三氟乙酸为酰化试剂,进行酰化反应后与盐酸成盐得5,10- 亚甲基四氢叶酸盐酸盐,最后经水解与氯化钙成盐得亚叶酸钙。整个过程收率为40%,经HPLC 检测,成品纯度高达99.68%,单杂0.11%,总杂0.79%。