张 茵,刘溪南,王 静,刘 娟
(1.河北省生态环境监测中心,河北 石家庄 050035;2.中国南水北调集团中线有限公司 河北水质监测中心,河北 石家庄 050035;3.石家庄高新技术产业开发区供水排水公司,河北 石家庄 050035)
粪大肠菌群又称耐热大肠菌群,44.5 度培养24 h,能产生β- 半乳糖甘酶,分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D 吡喃半乳糖甘生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。粪大肠菌群目前常用检测方法有:多管发酵法、滤膜法、纸片法和酶底物法。
其中滤膜法主要用于杂质较少的水样,与多管发酵法相比,检测相对简单,也需要进行验证实验。
荧光光度法原理:粪大肠菌群与各特性培养基反应,生成疏水荧光产物,释放出荧光,以此原理来测定水样中粪大肠菌群菌落数的方法。
目前该方法已在2014 年通过美国环境保护局EPA 标准用于检测水中粪大肠菌群(40 CFR Part 141),同时在2014 通过美国分析化学家协会AOAC 标准用于检测水中粪大肠菌群。
本文采用荧光光度法种方法检测不同梯度浓度的定量微生物质控(NSI-QC)菌株,采用酶底物和荧光光度法种方法检测石家庄、唐山、温州等不同地区的不同类型(生活饮用水、水源水、污水、景观用水) 的样品,按照数理统计规则进行数据分析,通过比对数据判断荧光光度法的准确度和两种方法的相关性。
粪大肠菌群培养基:Fecal Coliform Agar(简称:Tectalert FCA)、100 mL 检测瓶、定量微生物质控(NSI-QC)菌株、灭菌后的生理食盐水等耗材、大肠菌群荧光检测仪购自爱德士公司。定量盘、程控封口机、科立德试剂、100 mL 样品瓶(均购于爱德士公司);ZXGP-B2080 隔水式恒温培养箱(上海智诚分析仪器制造有限公司) 温控精度为±0.5 ℃。
1.2.1 高浓度定量微生物质控(NSI- QC)样品的制备
定量微生物质控(NSI-QC)菌株从-10 ℃冰箱取出,首先在室温下平衡温度10 ~15 min,随后将质控菌株转移入预先准备好的100 mL 灭菌后的生理食盐水中,轻轻振荡,待全部溶解后,将10 mL样品加入90 mL 无菌生理食盐水中作10 倍稀释,在水合作用30 min 内进行检测,分别采用酶底物法和荧光光度法测定浓度值。
1.2.2 低浓度定量微生物质控(NSI- QC)质控样品制备
定量微生物质控(NSI-QC)菌株从-10 ℃冰箱取出,首先在室温下平衡温度10 ~15 min,随后将质控菌株转移入预先准备好的100 mL 灭菌后的生理食盐水中,轻轻振荡,待全部溶解后,稀释10倍,在水合作用30 min 内进行检测,分别采用酶底物法和荧光光度法测定浓度值。
1.2.3 实际样品采集
根据日常检测的数据分别采集石家庄、唐山、邢台、江门、温州等不同地区水源水(地表水)、景观水、污水等,分别用两种方法进行测定。
1.2.4 荧光光度法测定水中粪大肠菌群
将100 mL 待测样品加入在检测瓶中加入2 g培养基(Tectalert FCA) 放置于大肠菌群荧光检测仪中,选择测定粪大肠菌群。根据浓度自动读取数据(检测时间2 ~18 h)。
1.2.5 酶底物法测定水中粪大肠菌群
酶底物法检测步骤参照《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》(HJ1001-2018),培养温度44.5 ℃,24 h,样品变为黄色判断为粪大肠菌群。
将不同浓度粪大肠菌群定量微生物质控(NSI-QC)质控样品用荧光光度法平行检测6 次。将结果与定量质控的真值范围进行比较,所有结果均在定量质控的真值范围内,合格率为100%。
荧光光度法测定中浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果见表1。
表1 荧光光度法测定中浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果Table1 Results of quantitative microbiological quality control(NSI-QC)samples in fluorometric determination
荧光光度法测定低浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果见表2。
表2 荧光光度法测定低浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果Table 2 The results of lowconcentration quantitative microbiological quality control(NSI-QC)samples were determined by fluorimetry
荧光光度法测定高浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果见表3。
表3 荧光光度法测定高浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果Table 3 The results of high concentration quantitative microbiological quality control(NSI-QC)samples were determined by fluorimetry
由不同梯度的质控浓度测定结果可以得出结论,荧光光度法测定粪大肠菌群的结果在质控范围内,准确度满足相关要求。
分别从全国不同地区选择水源水(地表水)、景观水、污水等及灭菌水,用荧光光度法和酶底物法同时对样品进行检测。为进一步探究两种方法在检测样品 时是否存在差异性运用软件SPSS Statistics 软件对滤膜法和光度法的检测结果进行t检验分析,为了使检测结果呈正态分布,将检测结果作对数处理后再进行t 检验分析,结果如表5 所示。通过对数据进行统计分析,说明荧光光度法与酶底物法具有高度一致性。
水源水数据分析(地表水) 见表4。
表4 水源水数据分析(地表水)Table 4 Source water data analysis(surface water)
景观水数据分析见表5。
表5 景观水数据分析Table 5 Analysis of landscape water data
污水数据分析见表6。
表6 污水数据分析Table 6 Sewage data analysis
对表4 ~6 数据酶底物法和荧光光度法检测结果进行配对T 检验,为了使数据呈正态分布,对数据进行对数处理后再进行配对T 检验。由以上数据可知样品测定值经过计算,P=0.078>0.05,说明酶底物法和荧光光度法的结果无显著性差异,具有统计学意义。
配对样本检验结果见表7。
表7 配对样本检验结果Table 7 Results of paired samples
取灭菌后的生理食盐水14 组,用荧光光度法在无菌环境和有菌环境中进行测定,测定结果均为阴性。实验结果见表8。
表8 无菌环境下荧光光度法测定灭菌后的生理食盐水结果Table 8 Determination of saline solution after sterilization by fluorimetry in a sterile environment
有菌环境下荧光光度法测定灭菌后的生理食盐水结果见表9。
表9 有菌环境下荧光光度法测定灭菌后的生理食盐水结果Table 9 Determination of saline solution after sterilization by fluorimetry in a sterile environment
通过分别采用荧光光度法和酶底物法对高、中、低不同浓度的NSI 粪大肠菌群定量质控样品检测结果分析,二者相差不大,具有等效性。
对水源水(地表水)、景观水、污水等样品进行检测后,对数据进行统计分析,t 检验结果为P=0.078(>0.05),说明酶底物法和荧光光度法的检测结果无统计学差异,均可有效检测水中粪大肠菌群数。
荧光光度法检测无菌生理食盐水无菌环境和有菌环境下下,检测结果均为阴性,说明荧光光度法无需在专业无菌室环境操作,节省了实验室建设成本的同时也满足了应急检测的需求。
(1) 荧光荧光光度法测定数据时间较短(2 ~18 h 即可得出检测结果)
(2) 荧光光度法可以自动计数,规避了由于酶底物观察时间不同、对结果测定结果判断误差引起的读数偏差。
(3) 荧光光度法测定范围范围广,最高108·100 mL-1。
酶底物法和荧光光度法优缺点比较见表10。
表10 酶底物法和荧光光度法优缺点比较Table 10 Compare the advantages and disadvantages of enzyme substrate method and fluorescence method
(1) 荧光光度法测定不同梯度浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品,测定结果均在不确定度范围内,说明该方法的准确度满足测定要求。
(2) 2 种方法检测结果无明显差距,具有等效性。
(3) 荧光光度法测定范围广(最高可测定108 CFU/100 mL)。
(4) 自动读取实验数据,规避了由于读取时间不同对测定结果的影响,更适合实验室日常检测和应急检测。