犬弓形虫巢式PCR 检测方法的建立及初步应用

柳方远，李双星，印春生，吉 婧,3，朱明哲,3，刘业兵

（1.中国兽医药品监察所，北京10081；2.张家港市畜牧兽医站，张家港 215600；3.青岛农业大学，青岛 266109）

刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）是一种专性细胞内寄生原虫，对人、动物健康带来严重影响。全球约三分之一的人感染弓形虫，我国弓形虫阳性率约为8%[1]。健康人群感染弓形虫通常不会造成明显的临床症状，免疫缺陷者感染会造成严重的后果，甚至死亡，孕妇感染弓形虫会垂直传播给下一代，甚至会造成胎儿流产、死胎[2-3]。弓形虫也广泛感染动物，其中猪的感染率为25.8%，山羊的感染率为3.9%～19.2%，牛的感染率为0.2%～43%，鸡的感染率为15%～20%，犬的感染率为3.69%～43%，猫的感染率可高达70%[4-5]。对畜牧业造成了严重的经济损失，犬猫等宠物感染还会给人类公共健康造成隐患。

犬感染弓形虫病通常是由于吞食了含有弓形虫滋养体及包囊的肉、内脏、排泄物等，此时犬体内会产生子孢子或滋养体，最终形成包囊并在机体组织中长时间停留，成为弓形虫传播的中间宿主[6]。大多数健康的成年犬感染弓形虫后为隐性感染，少部分犬症状类似犬瘟热和犬传染性肝炎，主要表现为发热、咳嗽、精神萎靡、虚弱、呼吸困难，甚至出现剧烈的出血性腹泻，严重会致死[7]。如果犬感染弓形虫没有被及时发现，会对人和动物造成严重的健康威胁。ChineseⅠ虫株是我国人和动物感染的主要基因型，关于该虫株的致病机理和入侵规律尚不清楚，我国关于犬弓形虫感染的相关研究较少，且尚未发现以犬为模型探索弓形虫速殖子在其体内的分布规律的研究报道。因此，高效检测犬的弓形虫感染、摸清弓形虫在犬体内的组织分布对预防和控制弓形虫的传播具有重要意义。本研究旨在建立一种适合犬弓形虫感染的组织检测方法，以期为犬弓形虫病的致病机理和病理学诊断提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞、虫株及试验动物 弓形虫ChineseⅠ虫株、Vero细胞均由中国兽医药品监察所提供；牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬新孢子虫基因组由中国农业科学院兰州兽医研究所馈赠；比格犬在华派生物工程集团有限公司动物房饲养试验。

1.2 主要仪器与试剂 Percol l纯化液购自索莱宝公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；ExTaq聚合酶、DNA Marker购自TaKaRa公司；DMEM培养基购自Gibco公司；超微量分光光度计购自德国Colibri公司；高速离心机购自美国Sigma公司；凝胶成像系统购自美国BIORAD公司；梯度PCR仪购自德国耶拿公司；核酸电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.3 弓形虫DNA的制备 使用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基培养Vero细胞，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，1～2 d换一次液。待Vero细胞长满70%～80%细胞瓶时，更换2%胎牛血清细胞维持培养基待用。复苏冻存的弓形虫ChineseⅠ株，接种入Vero细胞中培养。培养1周左右，待细胞基本脱落且虫体大量溢出时，收集弓形虫速殖子，并使用Percol l试剂纯化。将纯化后的弓形虫速殖子按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行基因提取，经核酸蛋白测定仪测定浓度后保存备用。

1.4 组织样品的准备 弓形虫感染比格犬：选择日龄一致，体格相似的SPF比格犬6只，试验犬编号为2117、2118、2119、2120、2076，2123。将2×104个/mL弓形虫速殖子耳缘静脉注射比格犬5只，每只注射0.5 mL，设置1只空白对照犬，攻虫42 d后解剖。犬的解剖和组织采样：将攻虫犬和空白对照犬心脏采血后处死，使用解剖器具将犬进行解剖，取脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腹膜肌、舌肌、淋巴结、睾丸。分别从组织四周及中央剪取5个点的病料组织块，每点组织块约1 cm×1 cm×1 cm大小。犬生殖器（睾丸或子宫）取整体的1/3，犬颈下淋巴结取全部。将每种组织病料置于研磨钵中剪碎，混合均匀，加入液氮辅助研磨成粉状，装入自封袋，做好标记，使用试剂盒提取DNA。

1.5 引物的设计与合成 根据GenBank（登录号：DQ779191.1）发表的弓形虫529 bp重复序列，通过Primer Premier 5.0软件设计巢式PCR引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 529 bp 重复序列基因引物设计Table 1 Primers specif ic for 529 bp repetitive sequence gene

1.6 PCR扩增 第1轮PCR反应体系：2×ExTaq酶10 μL，Toxo-outF/R各1 μL，弓形虫DNA模板5 μL，ddH2O 3 μL。反应条件：98℃预变性5 min；共95℃变性1 min，64℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环；72℃再延伸10 min。第2轮PCR反应体系：2×ExTaq酶10 μL，Toxo-innerF/R各1 μL，第1轮PCR反应产物5 μL，ddH2O 3 μL。反应条件：98℃预变性5 min；95℃变性1 min，66℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30个循环；72℃再延伸10 min。

1.7 特异性试验 用建立的巢式PCR方法检测弓形虫、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬新孢子虫基因组，使用ddH2O作阴性对照，检测巢式PCR方法特异性，琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.8 灵敏度检测 使用超微量分光光度计测出弓形虫DNA的浓度，然后使用ddH2O将其连续10倍比稀释，以此作为模板，使用国标PCR方法（GB/T 18448.2，2008）和所建立的巢式PCR方法进行检测比较。统计可检测出的弓形虫DNA的最低浓度。国标PCR方法引物序列见表2，反应体系为：2×ExTaq酶25 μL，引物各1 μL，样品2 μL，ddH2O 21 μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30个循环；72℃再延伸8 min。

表2 国标PCR 引物序列Table 2 National standard PCR primer sequence

1.9 重复性试验 将弓形虫DNA作为模板，按照1.5 PCR扩增的条件和方法做3组重复试验，验证该方法的重复性。

1.10 临床检测 将研磨后的组织按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。将提取的60份犬的组织DNA样品稀释成同浓度，作为模板，用建立的巢式PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 特异性试验 利用本研究所建立的巢式PCR方法对牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬新孢子虫基因组和空白对照组进行扩增，无条带出现，而对弓形虫阳性对照组的扩增在529 bp处有明显的条带，与目的片段的大小一致（图1），说明该方法的特异性高。

图1 特异性试验结果Fig.1 The result of specif icity test

2.2 灵敏度检测 将10倍系列稀释的基因组作为模板，分别采用建立的巢式PCR方法和国标PCR方法进行检测。巢式PCR方法对弓形虫529 bp重复序列的最低检测量是0.134 pg，国标PCR方法最低检测浓度为13.4 pg，说明建立的PCR方法检测灵敏度较高，比国标PCR高100倍（图2，图3）。

图2 国标PCR 灵敏度检测结果Fig.2 Result of national standard PCR

图3 巢式PCR 灵敏度检测结果Fig.3 Result of Nested PCR

2.3 重复性试验 使用巢式PCR做3组重复试验，加入模板的泳道均能扩增出529 bp的条带，且条带清晰，易于观察。说明建立的巢式PCR方法重复性较好（图4）。

图4 重复性试验结果Fig.4 Result of repeatability test

2.4 临床检测结果 使用巢式PCR检测方法检测感染犬组织DNA样品，在攻虫犬2117的脑组织样品，攻虫犬2118的舌肌、脾脏，攻虫犬2119的肾脏，攻虫犬2120的心脏、睾丸，攻虫犬2076的心脏、腹膜肌检测出弓形虫529 bp基因，阴性对照犬2123无条带出现，未检测出弓形虫感染（图5）。

图5 临床样品检测结果Fig.5 Result of samples test

3 讨论

用于弓形虫的检测方法主要包括病原学检测、免疫学检测及分子生物学检测等。病原学检测应用较少，免疫学检测适用于弓形虫的血清学检测，灵敏度和特异性较高，应用广泛；分子生物学检测主要有核酸探针、PCR、环介导等温扩增技术等，被广泛应用于病原体检测[8-9]。PCR技术在弓形虫检测中可以在较短的时间内对弓形虫基因组特定的片段进行扩增，检测速度快、灵敏度高、结果可靠[10]。

目前弓形虫PCR检测方法应用较广，常用的靶基因有B1、P30、529 bp重复序列等[11]，相对于其他基因，529 bp重复序列具备更高的拷贝数。本研究以重复序列529 bp基因为靶基因，建立了犬弓形虫巢式PCR检测方法[12]。结果显示，最低检出弓形虫DNA浓度为0.134 pg，比国标普通PCR检测方法的灵敏度高100倍，因此本方法灵敏度较高。利用巢式PCR方法对其他常见寄生虫的基因进行扩增，结果无条带，说明该方法特异性强。重复性试验做了3次，表明该方法稳定。对感染弓形虫的犬组织DNA样品检测后发现，能够在心脏、大脑、舌肌、脾脏、肾脏、睾丸、腹膜肌中检测出弓形虫DNA。以上数据表明本方法可用于临床疑似弓形虫感染样品的检测，为后续弓形虫在宿主体内的动态分布研究奠定技术方法。

随着宠物犬数量不断增多，研究发现犬感染弓形虫的比例不断增长，犬弓形虫病对人和动物造成的健康威胁日益增大。弓形虫进入宿主体内粘附、侵入和增殖的过程十分复杂，其在不同动物不同组织中的分布规律存在差异，目前对于中国流行株弓形虫ChineseⅠ的致病性及组织分布研究较少。因此，探讨弓形虫对犬组织嗜性研究，建立快速有效的检测方法将有助于对弓形虫感染机制的理解，为弓形虫的检测与诊断提供新的思路。