基于黑曲霉固态发酵的绿豆皮降解及理化特性提升机理

赵一帆, 罗 磊, 马 潇, 刘浩宇

(河南科技大学食品与生物工程学院,洛阳 471023)

绿豆在我国有2000余年的种植史,种植地区非常广泛[1]。绿豆皮是绿豆加工过程中的主要副产物,绿豆皮中含有大量的膳食纤维及各种活性成分[2-7]。但绿豆皮中纤维素的含量较高[8]、难以粉碎至口感较好的程度,导致绿豆皮本身的良好保健功能难以表现,大部分绿豆皮被弃置或用于牲畜饲料[9],这大大浪费了其价值。传统的制粉方法主要采用螺杆挤压、超微粉碎、高温高压等方法来破坏绿豆皮结构,但都存在需求大型设备、耗能较高、成本较高等问题。

微生物法具有能耗低、成本低廉等优势。且微生物本身分泌的多种酶类能够有效破坏绿豆皮的植物细胞壁[10]。使用微生物法来改善高纤维作物加工产品有较好的作用。徐安民[11]使用白腐菌固态发酵麦麸中的木质纤维素来改善小麦麸皮面条的粗糙口感,Wu等[12]使用米曲根瘤菌改善麦麸风味的同时也增加了其淀粉消化率,裴曾薇[13]对香菇柄膳食纤维使用黑曲霉改性后持水力、持油力、葡萄糖吸附能力等理化特性均得到提升。黑曲霉作为一种常见发酵曲霉,已广泛应用于工业生产中,其能产生多种酶如纤维素酶、木聚糖酶、糖化酶等,且不产生真菌毒素[14]。

本研究用黑曲霉对绿豆皮进行固态发酵,并以体积平均径、比表面积为指标,考察制粉特性的改善,持水力、持油力、膨胀力、溶解性、胆酸钠吸附能力、阳离子交换能力及葡萄糖吸附能力为指标,考察绿豆原皮(GY)与黑曲霉固态发酵后绿豆皮(GH)的理化特性提升。采用扫描电镜、X射线衍射及红外光谱法考察黑曲霉固态发酵对绿豆皮微观结构与化学键的影响,初步探究绿豆皮被降解的机理,以期为提高绿豆皮利用率以及扩宽其应用面提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种与样品

黑曲霉(Aspergillusniger),为本实验室保藏菌种;绿豆皮,洛阳产。

1.2 试剂与设备

PDA营养琼脂、LB肉汤、LB营养琼脂,生物试剂(BR);葡萄糖、凡士林、石蜡油、氯化钠、溴化钾,分析纯(AR);牛胆酸钠,化学纯(CP)。

SW-CJ-1D型单人净化工作台,DHP9272电热恒温培养箱,YXQ-LS-50S自动高压灭菌锅,T6紫外可见分光光度计,BJ-150多功能粉碎机,TM3030Plus台式扫描电镜,VERTEX70傅里叶变换中远红外光谱仪,Xstress3000(G2)X射线衍射仪。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

取清洗、烘干后的绿豆皮50 g于1 L锥形瓶中,用透气膜封口,于全自动高压锅121 ℃下灭菌20 min后进行固态发酵。取经过菌种分解的绿豆皮,摊开后放入55 ℃鼓风干燥箱烘干过夜。然后使用万能粉碎机对绿豆皮进行粉碎后过125 μm筛网,粉碎时间为2 min。收集粉末,放置在干燥器中于4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 菌种活化及种子液的制备

黑曲霉孢子悬浮液的制备:参考吴红影等[15]的方法并稍作修改。

1.3.3 绿豆皮发酵

在接种黑曲霉孢子量2×107个、温度36 ℃、时间7 d、料液比1∶3的条件下进行固态发酵。

1.3.4 绿豆皮制粉特性的测定

粒径分布及比表面积测定:取相同条件粉碎后的适量绿豆皮粉于烧杯,倒入激光粒度分布仪进行测定,物质折射率为1.52,介质为水,折射率为1.33。为方便描述将绿豆原皮用GY表示,黑曲霉固态发酵后绿豆皮用GH表示,余同。

1.3.5 绿豆皮理化特性测定

1.3.5.1 持水力测定

参照Tian等[16]的方法并稍作修改,计算持水力。

(1)

式中:WH为绿豆皮粉的持水力/g/g;m0为干燥样品质量/g;m1为离心管质量/g;m2为离心管和沉淀质量/g。

1.3.5.2 溶解性测定

参照王萍等[17]的方法并稍作修改,计算溶解性。

(2)

式中:WS为绿豆皮粉的溶解性/%;m0为样品质量/g;m1为平皿质量/g;m2为烘干后的上清液和平皿质量/g。

1.3.5.3 膨胀力测定

参照Oluwatoyin等[18]的方法并稍作修改,计算膨胀力。

(3)

式中:PL为绿豆皮粉的膨胀力/mL/g;V1为初始体积/mL;V2为溶胀后体积/mL;m0为样品质量/g。

1.3.5.4 持油力测定

参照Kurek[19]的方法并稍作修改,计算持油力。

(4)

式中:OH为绿豆皮粉的持油力/g/g;m2为离心管和样品质量/g;m1为离心管质量/g;m0为样品质量/g。

1.3.5.5 阳离子交换能力测定

参照Wei等[20]的方法稍作修改。

1.3.5.6 胆酸钠吸附能力分析

胆酸钠吸附能力测定:参照王雅琪[4]的方法稍作修改。

1.3.5.7 葡萄糖吸附能力分析

葡萄糖吸附能力测定:参照Peerajit等[21]的方法稍作修改。

1.3.6 绿豆皮降解机理研究

1.3.6.1 扫描电镜观测

将样品台放入扫描电镜,抽真空并观测。具体条件:加速电压为 15 kV,模式为“Standard”,图片扫描倍数为 80～500倍。

1.3.6.2 傅里叶红外光谱扫描

将制得的样品压片在4 cm-1分辨率4 000～400 cm-1区间进行扫描,扫描次数设置为64次,KBr做空白样品,每个样品做3次平行实验。

1.3.6.3 XRD射线衍射表征

对经黑曲霉固态发酵绿豆皮粉和原粉分别进行X-射线衍射检测,具体条件:Cu 靶、管压力为 40 kV、电流为 30 mA、扫描速率为2(°)/min、起始角:5°、终止角:90°、采样步宽 0.05°。

1.3.6.4 绿豆皮主要组分变化

采用Van Soest 洗涤法并参考陈露露[22]的方法稍作修改进行测定。

1.3.7 数据处理

每组样品做3次平行实验,取平均值,实验数据采用IBM SPSS statistics 26进行数据统计,使用沃勒-邓肯法进行显著性分析,利用Origin 2021软件作图,利用Design Expert 12软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉固态发酵对绿豆皮制粉特性的影响

GY与GH的粒径与表面积大小如表1所示,经过黑曲霉固态发酵,在相同粉碎条件下,绿豆皮粉的体积平均径由391.05 μm显著缩小到45.46 μm,减少了8.52倍。绿豆皮粉比表面积由8.51 m2/kg显著提升至279.07 m2/kg,增加了32.46倍。这是由于固态发酵破坏了绿豆皮的结构,使其易被粉碎为粒径更小的粉体。更小粒径的绿豆皮粉末,会带来更好的口感,改善绿豆皮制粉特性。

表1 绿豆皮粉的粒径及比表面积

2.2 黑曲霉固态发酵对绿豆皮理化特性的影响

2.2.1 水合特性

经过黑曲霉固态发酵的绿豆皮,溶解性得到显著提升(表2),增加了11.22倍,可能是因为固态发酵使绿豆皮中的一些大分子长链的不溶性成分被降解为小分子短链的可溶性成分。而固态发酵后比表面积的增加,使更多小型基团暴露,更易与水和油结合,持水力、膨胀力、持油力与阳离子交换能力得到提升,分别增加了1.07、1.03、1.20倍和1.11倍。溶解性的提升说明有更多的可溶性活性成分产生,而更高的持油力表明有更好的降血脂功能,阳离子交换能力的提高更有助于维持内环境的稳定[23]。

表2 绿豆皮的水合特性

2.2.2 胆酸钠吸附能力分析

对比吸附后上清液胆酸钠浓度可以看出,GH中胆酸钠溶液浓度要明显低于GY(图1),反应120 min时测得GY胆酸钠质量浓度为0.59 mg/mL,GH中胆酸钠质量浓度为0.34 mg/mL,吸附能力提升了1.18倍。这可能是因为固态发酵造成比表面积增大,使得更多基团暴露,更易于胆酸钠结合,同时更疏松的孔隙结构也有利于胆酸钠的吸附。对胆酸钠的吸附有利于胆固醇的消化,有助于提升绿豆皮的降血脂作用。

图1 胆酸钠浓度变化图

2.2.3 葡萄糖吸附能力分析

在相同葡萄糖浓度下,GH相较于GY的葡萄糖吸附量更大(图2),在200 mmol/L的葡萄糖浓度下,GH的葡萄糖吸附能力提升了1.17倍。这说明固态发酵使绿豆皮具有更好的葡萄糖吸附能力。这可能是因为发酵后更高的可溶性膳食纤维形成胶质网状结构将葡萄糖捕获[24],同时更加疏松的结构也更易吸附葡萄糖。而更强的降血糖能力,能够有效预防高血糖与糖尿病等疾病[25],有助于绿豆皮应用在保健食品中。

图2 不同葡萄糖浓度对GY与GH吸附能力的影响

2.3 绿豆皮降解机理研究

2.3.1 扫描电镜分析

从电镜扫描图可以看到(图3),绿豆皮发酵前后发生明显的变化,左侧GY表面结构完整均匀,仅有少量褶皱和空隙,而右侧GH表面褶皱与孔隙明显增多,并出现颗粒状物质。这说明黑曲霉固态发酵对绿豆皮的表面结构造成了明显破坏,其原因可能是纤维素、半纤维素的降解造成绿豆皮变得疏松多孔,这与符旭栋[26]使用微生物发酵改性柠檬皮渣的研究结论相似。

图3 绿豆皮的扫描电镜图(×500)

2.3.2 傅里叶红外光谱扫描结果及分析

通过对绿豆皮粉红外光谱分析可知(图4),3 330 cm-1出现较宽吸收谱带是绿豆皮纤维素与半纤维素的O—H伸缩振动产生,2 922 cm-1附近吸收峰为糖类亚甲基中C—H伸缩振动[27],在1 321 cm-1处的吸收峰是木质素组分的拉伸或弯曲特征峰,1 060 cm-1的较宽吸收是纤维素和半纤维素C—O、C—C、C—O—C的拉伸。从图4中可以看到,GH和GY的红外光谱基本一致,但GH纤维素、半纤维素及木质素特征峰的吸收明显减弱,这可能是黑曲霉固态发酵能够部分破坏纤维素、木质素等的化学键,并降解纤维素木质素等不溶性膳食纤维成分造成的。

图4 绿豆皮的红外光谱图

2.3.3 XRD射线衍射表征结构及分析

通过对绿豆皮粉的X射线衍射谱图的分析,GY与GH出峰位置基本相同(图5),均在扫描角度为22.62°处出现主衍射峰,15.00°和34.66°出现次衍射峰,呈现出典型的纤维素Ⅰ型晶体结构[28]。但GH峰值明显低于GY,说明黑曲霉固态发酵后的绿豆皮结晶区所占面积有明显下降。这可能是固态发酵过程中部分结晶区结构被破坏,向非定性区进行转化,相对结晶度下降,导致绿豆皮膳食纤维聚合度降低,这与刘鸿铖等[29]的研究结果是相似的。

图5 绿豆皮的X射线衍射图

2.3.4 绿豆皮主要组成变化分析

根据图6的观察结果可知,在降解的初期阶段,绿豆皮中的木质素和半纤维素的降解速度高于纤维素,在中期阶段纤维素的降解速度开始提升,半纤维素的降解速度也随之提高。说明黑曲霉对绿豆皮成分的降解过程中,先降解包裹在纤维素上的木质素和半纤维素,随着酶的进一步作用,纤维素才开始降解,而纤维素的降解又会促进附着在其表面的半纤维素的降解。黑曲霉对绿豆皮中纤维素的降解率最高,达到57.71%;其次是半纤维素,降解率为46.00%;最低的是木质素,降解率为43.27%。而李红亚等[30]对玉米秸秆进行降解,纤维素和半纤维素的降解率仅为30.5%和41.4%。这表明黑曲霉对绿豆皮有较好的降解能力,特别是对绿豆皮中含量最高的纤维素具有有效降解作用。

图6 纤维素、半纤维素及木质素降解率变化

3 结论

研究黑曲霉固态发酵对绿豆皮特性的影响,并进行了降解机理的探究。结果表明,在制粉特性上,经过黑曲霉固态发酵后绿豆皮的粒径明显下降8.53倍、比表面积显著上升32.46倍,这将有利于绿豆皮粉的加工与利用。在理化特性上,经过黑曲霉固态发酵后绿豆皮的持水力、溶解性、膨胀力、持油力、阳离子交换能力、胆酸钠吸附能力及葡萄糖吸附能力等均得到明显提升。在降解机理上,主要通过电镜扫描、红外扫描及XRD晶体衍射进行探究。黑曲霉对绿豆皮的降解,先降解木质素与半纤维素,再降解纤维素。主要通过破坏纤维素、半纤维素及木质素的化学键,使长链结构被降解为短链结构,破坏结晶区结构,降低相对结晶度,并转化纤维素、半纤维素、木质素等主要成分,进而破坏绿豆皮结构,使其变得疏松多孔,让绿豆皮更易被粉碎为粒径更小、比表面积更大的粉体,具有更好的物质交换效率,提升绿豆皮的理化特性。