低密度中性粒细胞的表型和功能多样性

李佳玉 张野 黄长形 （空军军医大学第二附属医院传染病科，西安 710038）

中性粒细胞是人体数量最多的白细胞，占循环白细胞的50%～70%，在机体发生感染时首先被招募至感染部位，是宿主抵御外来病原体入侵的第一道防线，在清除病原体方面起重要作用［1-2］。中性粒细胞可通过吞噬、排出颗粒内容物和释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）等方式发挥免疫防御及清除病原微生物等作用［3-4］。长期以来，人们一直认为中性粒细胞是一种非特异性终末分化细胞，具有特定细胞核形态，功能单一，半衰期短，转录活性低［5-6］。但越来越多的研究者认识到中性粒细胞是一种更为复杂的细胞，可合成细胞因子、趋化因子，对适应性免疫也发挥调节作用，具有不均一性和可塑性的特点［7-10］。在炎症反应中，中性粒细胞受多种细胞因子和趋化因子诱导发生活化使其寿命延长并呈现不同细胞表型［11-12］。越来越多的研究证实，在不同生理或病理状况下，循环或组织中的确存在不同中性粒细胞表型和不同功能的中性粒细胞亚群［2，6，11，13］。

中性粒细胞的异质性是免疫病理生理学的重要特征［5，13］。有研究者已提出基于其成熟程度评估中性粒细胞亚群的策略［14-15］。但近20年来，越来越多的研究者根据中性粒细胞密度进行分群。密度梯度离心采用Ficoll分离技术，这种技术在1976年开始应用，常用于从人外周血白细胞中分离单个核细胞［16］。血液白细胞分层于Ficoll溶液，在离心过程中根据密度不同导致包含不同细胞类型的层形成。由于外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）密度较低（包括淋巴细胞和单核细胞），位于血浆和Ficoll之间的界面，而正常密度中性粒细胞和红细胞位于底层。脓毒血症、肿瘤、病毒感染、过敏性哮喘及系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）病理情况下，将患者全血密度梯度离心后，PBMCs中存在一个与正常密度中性粒细胞功能不同的低密度中性粒细胞亚群［14，17-23］。人们将中性粒细胞这个重要且独特的亚群称为低密度中性粒细胞（low density neutrophils，LDNs）。

LDNs名称的由来是相对于红细胞层分离出的正常密度中性粒细胞（normal density neutrophils，NDNs）或高密度中性粒细胞（high density neutrophils，HDNs）而言的。LDNs由活化的成熟中性粒细胞和不成熟的中性粒细胞共同组成［14］。在细菌、病毒等病原微生物所致感染性疾病和自身免疫性疾病中，中性粒细胞被招募和激活，一部分NDNs活化脱颗粒，导致密度降低，浮力改变，还有部分未成熟的中性粒细胞从骨髓中过早释放，这两种原因都使LDNs与PBMCs在同一密度梯度中共存［7，22］。流式细胞术测定表面标志物表达可区别PBMCs中的单核细胞和LDNs。单核细胞高表达CD14和低表达CD15，LDNs高表达CD15和低表达CD14［24］。LDNs的表面标志物主要为CD66b、CD11b、CD16、CD10等，CD66b是一种特定的粒细胞标志物，参与呼吸暴发［8］；CD11b存在于明胶酶颗粒膜，分泌囊泡；CD16是成熟中性粒细胞标志物，参与脱颗粒；CD10亦是一种中性粒细胞成熟标志物，有研究发现CD10表达可将LDNs明确分为成熟和不成熟细胞，成熟的CD10+亚群表现为抑制T细胞增殖，而不成熟的CD10-亚群则表现为促进T细胞增殖［6］。不同疾病的LDNs表面标志物不同，如多发性骨髓瘤患者LDNs表达为CD11b+CD14-CD33+CD15+HLA-DRlow/-；HIV患者LDNs表达为CD15highCD33highCD66bhighCD62LlowPD-L1low［8］。目前研究发现，在多种疾病中LDNs比例明显升高，在固有和适应免疫反应中发挥重要作用［14］。而在健康人体内，LDNs比例极低［6］。

中性粒细胞表型在表面标志物功能表达方面也存在异质性［25］。根据其功能LDNs可分为促炎LDNs［也称低密度粒细胞（LDGs）］和免疫抑制性LDNs［也称粒细胞源性抑制细胞（PMN-MDSCs/GMDSCs）］。如在SLE和牛皮癣患者中发现的LDNs具有促炎功能，而在癌症、慢性细菌和病毒感染、创伤和败血症多种病理条件下，PBMCs中发现的骨髓衍生抑制细胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）则具有免疫抑制功能。下面重点介绍SLE和癌症中LDNs的表型和生物学特征。

1 SLE与促炎LDNs（LDGs）

SLE是一种严重的慢性且无法治愈的自身免疫性疾病。SLE患者血液中出现大量不成熟的嗜中性粒细胞，中性粒细胞失调与SLE的发病机制有关［21，26］。1986年，研究者从成年SLE患者获得的PBMCs制剂中发现了“低浮力密度中性粒细胞”［27］，越来越多的研究证明采用密度梯度法可在PBMCs中分离出LDNs。

SLE患者的LDNs表达CD15、CD16b、CD33和CD11b，与NDNs不同的是，SLE患者的LDNs表达更高水平的激活标志物CD11b、CD66b、CD63和CD107a。LDNs的表面标志还发现了CD11c、CD31、粒细胞集落刺激因子受体和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体。重要的是，SLE中LDNs执行中性粒细胞功能的能力是两极分化的，基于成熟的CD10+和不成熟的CD10-中性粒细胞。SLE患者的HDNs中90%为成熟细胞，而LDNs中60%为成熟细胞。

LDNs在SLE患者循环中明显升高，CARMONARIVERA等［27］发现其检查的成年SLE患者PBMCs层均存在LDNs。LDNs能积极产生炎症细胞因子并在体外杀死内皮细胞，具有促炎功能。研究表明，SLE中的LDNs分泌的促炎细胞因子水平升高、吞噬功能受损、NETs形成增多［14］。值得注意的是，SLE患者的LDNs显示NETs形成增强，生成NETs能力增强依赖于线粒体ROS，通过增强线粒体ROS生成的NETs，在诱导Ⅰ型干扰素和其他炎症细胞因子方面比其他刺激生成的NETs具有更强的免疫刺激性，提示这种类型中性粒细胞的存在可能是其他形式自身免疫性疾病的基础［28］。值得注意的是，LDNs产生NETs的能力因疾病而异，如在SLE和银屑病中，LDNs比同一患者的NDNs产生更多NETs；而在类风湿关节炎中，NETs形成似乎无差异［7］；高血压中NETs形成减少［22］。MISTRY等［21］也证实了LDNs的这些特性，利用个体和单细胞转录组学、表观遗传学和功能分析发现SLE患者的LDNs具有显著转录和表观遗传异质性，LDNs的转录因子基序分析与NDNs和健康对照中性粒细胞存在差异，各亚群在NETs形成、氧化线粒体DNA释放、趋化性、吞噬作用、脱颗粒、损害内皮能力以及对Ⅰ型干扰素刺激的反应等方面差异明显。

SLE的致病因素与Ⅰ型干扰素密切相关，超过50%SLE患者的干扰素通路被激活［29］。研究发现，SLE中的LDNs可增加Ⅰ型干扰素分泌，有助于炎症和组织损伤循环［14，21］。与其他免疫细胞亚群相比，LDNs的干扰素基因表达最高。不同LDNs亚群与狼疮的具体临床特征和冠状动脉疾病的存在和严重程度相关。LDNs在SLE中促进免疫失调和显著血管损伤［21］。

目前不少研究者将LDNs作为SLE治疗的新靶点，认为对致病性LDNs亚群的识别可能有助于开发靶向中性粒细胞群体的药物，同时保留中性粒细胞介导的宿主防御。LDNs中促进NETs形成或促进NETs清除的药物可能为SLE提供新的治疗策略。

2 癌症与免疫抑制LDNs（PMN-MDSCs/G-MDSCs）

中性粒细胞在肿瘤微环境中具有功能可塑性，同时具有促肿瘤和抗肿瘤功能，在癌症进展中起重要作用［30-32］。癌症早期，肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils，TANs）可能显示抗肿瘤特性，但在癌症晚期，中性粒细胞发挥增殖、侵袭和扩散以及免疫抑制功能促进癌症进展，因此多数研究将中性粒细胞描述为癌症进展的主要驱动力。一项对数千例人类癌症的荟萃分析发现，中性粒细胞与疾病预后差相关［33］。越来越多的研究将循环中的中性粒细胞数量和中性粒细胞与淋巴细胞的比例作为评估癌症进展的预后标志物［15，34-35］。

值得注意的是，中性粒细胞的表型和功能在肿瘤进展过程中变化较大［36］。大量关于癌症的研究都报道了一种中性粒细胞的亚群——LDNs，其比例随着癌症进展显著升高，因此LDNs往往成为循环中性粒细胞的主导群体［37］。LDNs已在乳腺癌、肺癌、头颈部癌症、泌尿系统癌症和淋巴瘤患者中被发现。据报道，晚期肺癌患者LDNs比例越高（＞10%）预示生存率越低［2］。癌症中的LDNs由未成熟的MDSCs和成熟的细胞组成［15］。癌症研究中，LDNs具有免疫抑制特性，通常也称为PMN-MDSCs/GMDSCs。

MDSCs是2007年提出的术语，代表未成熟髓样细胞的异质群体，参与疾病免疫调节各方面，包括癌症、感染、自身免疫性疾病、创伤等［38］。其中，MDSCs在肿瘤微环境内为抑制细胞并能防止肿瘤细胞被免疫消除［39］。MDSCs由两大群细胞组成：多形核MDSCs（PMN-MDSCs）和单核M-DSCs（M-MDSCs）［39-40］。PMN-MDSCs/G-MDSCs在表型和形态上与中性粒细胞相似，而M-MDSCs与单核细胞相似。

目前，从PMN-MDSC中分离中性粒细胞的唯一方法是梯度离心。最初使用术语“G-MDSCs”描述PMN-MDSCs，但目前发现PMN-MDSCs能更好地定义MDSCs这个亚群。PMN-MDSC在表型上不同于正常成熟的中性粒细胞，PMN-MDSC颗粒减少，浮力改变，CD16和CD62L表达减少，精氨酸酶1增加，CD11b和CD66b表达增加［38］。

人类PMN-MDSC的特征为CD11b+CD14-CD15+HLA-DR-或CD11b+CD14-CD66b+，小鼠PMN-MDSC特征为CD11b+Ly6GhighLy6Clow细胞和类似中性粒细胞。人类M-MDSC特征为CD11b+CD14+CD15-HLADRlow/-，由于HLA-DR低表达或缺失，M-MDSC可与单核细胞区分，小鼠M-MDSC特征为CD11b+Ly6GLy6Chigh［39，41］。可见PMN-MDSC和M-MDSC不仅在表型和形态上不同，且具有独特（虽然部分重叠）的功能特征和生化特征，这些特征反映其在不同病理条件下具有不同作用。

PMN-MDSCs的标志是其抑制T细胞功能的能力，与LDNs在SLE中的研究结果不同。两项调查SLE患者MDSCs的研究表明，PMN-MDSC表型细胞水平与升高的疾病活性和干扰素信号相关，但未抑制T细胞增殖或激活，因此是LDGs而非MDSCs［23，40］。

早期癌症发展过程中，NDNs占主导地位，导致整体抗肿瘤反应。随着癌症进展，LDNs成为主导，导致整个中性粒细胞表型转向促肿瘤功能。SAGIV等［37］研究发现，成熟的NDNs能够以依赖TGF-β的方式转换为LDNs，这种转换会成为LDNs——未成熟粒细胞骨髓源性抑制细胞（G-MDSCs），丢失了抗肿瘤特性却获得免疫抑制特性。虽然HDNs和LDNs可能来自共同的祖细胞，但其进入循环的释放受到不同调节。LDNs在循环中迅速积累，而NDNs在循环中出现的时间要晚得多。尽管不少研究证明中性粒细胞表型在体内发生了转换，但由于中性粒细胞回收程度低，这种转换的全部程度难以在体内评估［37］。

3 结论

中性粒细胞具有异质性和可塑性，在疾病中发挥复杂多样的功能，已证实中性粒细胞具有不同亚群。近20年来，具有促炎和免疫抑制功能的LDNs亚群得到广泛关注。研究表明，LDNs是一个异质群体，通常有很大比例的未成熟细胞。成熟细胞和不成熟细胞的比例与疾病种类及病情均有关。LDNs在固有和适应性免疫应答中发挥重要作用，活跃地参与病理性损伤，这是一个有希望干预的新治疗领域。研究该亚群有助于开发对疾病有针对性、有选择性的药物，如在SLE中，促炎LDNs能通过线粒体ROS产生增加NETs形成，因此直接靶向LDNs为研究新的治疗药物提供策略；癌症过程中，CCR5在引导免疫抑制性LDNs动员中起关键作用，因此建议将阻断CCR5作为癌症治疗的方法。目前尚无明确的标志物确定LDNs这个群体的深度特征。LDNs亚群的表型和功能差异需要进一步研究，作为一种新的治疗目标为疾病提供新的治疗策略。