小细胞外囊泡（sEVs）介导HBV感染及相关机制的研究进展

刘佳敏 张自力 曾蓉 徐旭 杨艳红 彭彬 戢敏 潘万龙

（1.川北医学院基础医学与法医学研究所，南充 637000；2.川北医学院电子显微镜结构研究单位，南充 637000；3.简阳市人民医院，成都 641400）

小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）作为细胞间通讯的重要桥梁，由脂质双分子层组成，内、外层膜在磷脂组成方面无明显差异，包含与本源细胞相同的内容物，如：DNA，核酸，蛋白质等。sEVs因其结构特异性而具有抗降解能力，在体液中可以保护包裹的物质不易被破坏，从而能够更好地促进物质的转运和调控［1］。大多数用于分离外泌体的方法也是共同分离不同生物源性的EVs异质群体的方法，所以2018年国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）重新定义了胞外囊泡。将直径小于200 nm的EVs定义为小EVs，大于或等于200 nm为大或中EVs［2-3］。近年来，细胞外囊泡因其特异性的结构和功能逐渐引起研究者广泛的关注和兴趣，特别是在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）研究方面［4］。

乙型肝炎是世界传染性疾病之一。全球有2.96亿人是慢性HBV携带者，约有100万携带者死于HBV严重并发症［5］。近年来，尽管乙型肝炎通过疫苗预防有效降低了新发疾病数量，但仍存在5%疫苗无应答个体，加之感染人群基数巨大，因此，诊断和治疗HBV感染仍是亟待解决的问题［6］。人体一旦感染HBV，HBV可能持续存在［7］。治愈乙型肝炎患者的基础在于充分掌握HBV复制调控的分子机制，HBV主要与肝细胞膜表面的肝胆汁酸转运蛋白牛磺胆酸钠共转运多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）或硫酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）受体结合进入细胞内部进行复制传播［8-9］，但近期发现这并不是HBV传染的唯一途径。据文献报道，除了受体途径以外，sEVs可以介导HBV传播未感染的肝细胞［10］。HBV与sEVs之间相互作用尚未被充分了解，因此迫切需要在这一领域进行进一步的研究，本文主要综述sEVs与HBV传递的关系及sEVs介导HBV感染的分子机制，为研究HBV持续感染提供新的视角。

1 HBV的生命周期

HBV是一种小包膜DNA病毒，通过吸附表面受体进入胞内释放核衣壳，松弛环状双链DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）穿梭到核内并转化为共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），转录病毒RNA并出核翻译，装载前基因组RNA（pregenomic RNA，PgRNA）和病毒聚合酶形成新的核衣壳，逆转录产生成熟的病毒粒子［11-12］。而聚集在内质网（endoplasmic reticulum，ER）-高尔基体（Golgi）中间隔室的HBV，一旦与核衣壳接触，便会触发包膜蛋白在MVB膜中形成紧密的排列，随后驱动向内出芽，产生完整的包膜病毒粒子。在HBV包膜病毒粒子的产生的过程中需要一种E类蛋白AIP1/Alix，这类蛋白是多泡体（multivesicular bodies，MVB）依赖病毒粒子的结合伙伴，与内吞体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）成分相互作用，从而可以催化MVB囊泡萌发的下游机制，并促进MVB的分选和囊泡的形成［13-14］。然而，ESCRT不仅是HBV病毒粒子包膜产生的重要成分，同时也是sEVs驱动、分选、膜形成和脱落的重要因子［15-16］。另外，sEVs中含有高水平的补体抑制蛋白（CD55，CD59），可以保护颗粒免受IG介导的补体招募和裂解的破坏，并且广泛的包膜病毒（即HIV-1，HBV等）能够挟持并利用ESCRT复合物从质膜上发芽［17］。而从质膜发芽的病毒粒子可通过网状蛋白介导的内吞作用（clathrinmediated endocytosis，CME）和持续大量的胞吞作用介导病毒感染，这些途径均可以允许sEVs进入。在sEVs内化后，可依靠脂质溶酶双磷脂酸（lysobisphosphatidic acid，LBPA），一种能使病毒穿透sEVs密切相关的离子，促进晚期内小体/多囊泡小体（LES/MVB）的sEVs的膜融合和伴随的内容物脱落［18］。新近研究表明，在慢性乙型肝炎患者中，从血清分离出来的纯化的sEVs含有rcDNA和cccDNA等核酸物质［19］。

以上研究表明，HBV病毒粒子的产生需要利用ESCRT复合物和MVB，sEVs可能通过MVBs与质膜融合使携带HBV病毒粒子从质膜上脱落，从而分泌到细胞外基质中。随后通过内吞途径胞吞sEVs，sEVs所包裹的DNA可脱落进入肝细胞内进一步完成病毒的周期循环。

2 HBV感染中sEVs的作用

sEVs作为细胞间生物活性分子运输的载体，其功能不仅取决于来源细胞，也依赖于其包裹内含物，sEVs中包含与HBV相关物质，如HBV DNA，编码和非编码RNA，蛋白质甚至相关的线粒体DNA，它们因脂质双分子的保护从而避免了降解，sEVs可作为细胞间的传播者，促进内容物在体外和体内的直接转移［20］。

2.1 HBV挟持sEVs进行传播 在HBV感染性疾病当中，除了受体途径之外，sEVs可作为HBV DNA的强大载体，将它们从受感染细胞运送到未受感染细胞，以促进HBV的传播［21-22］。有研究证明，慢性乙型肝炎患者血清中的sEVs能诱导内含物HBV DNA在幼稚的人肝细胞中活动性感染，进而促进病毒的转移［19，23］。sEVs生物发生的过程中有一种关键的酶即中性鞘磷脂酶2（neutral sphingomyelinase 2，nSmnase2），乙型肝炎x抗原（hepatitis B x antigen，HBx）可以通过诱导nSmase2的活性来增加sEVs的产生［24］。中性Ⅱ型鞘磷脂酶产生的神经酰胺参与sEVs的生物发生，介导膜亚结构域的形成，诱导MVBs膜向内出芽，并触发产生含有HBV DNA的sEVs，传递给未感染的肝细胞［25-26］。另外，sEVs除了可以介导HBV感染细胞DNA的传播之外，它还可以介导线粒体DNA（mtDNA）激活ATM-Chk2（共济失调毛细血管扩张症突变激酶及下游靶基因Chk2）信号通路，从而预防HBV相关的肝病［27］。

这些研究表明，在HBV感染中，HBV可挟持sEVs，在细胞间传递HBV DNA给未受感染的细胞介导病毒的传播，同时还可以介导细胞质DNA预防疾病的发生。

2.2 sEVs携带核酸对HBV感染的影响 sEVs中富集大量的编码和非编码RNA并可将它们运输到受体细胞，执行各种生理功能，调节转录后的基因表达，尤其是在病理情况下的调控更为显著［28］。在病毒感染过程中，sEVs携带的肝炎病毒因其分泌及组成受病毒感染的影响，除了可以扩大肝炎病毒的传播范围外，还可以携带大量的病毒抗原颗粒促进疾病发生［29］。在HBV感染的患者中，HBx蛋白存在时可以调节sEVs的生物发生机制，这些囊泡特异性地包裹HBx mRNA和蛋白，并在细胞外环境中脱落，从而影响内环境稳态［24］。同时，感染也会增加肝细胞中miR-21的表达，sEVs可携带miR-21下调IL-12的表达从而抑制NK细胞的活性［30］。然而，这些复杂的囊泡物质赋予了sEVs在机体正常和病理环境调节过程中具有相互矛盾的关系，其不仅能介导病毒的传播，还具有抵抗病毒的表现。

HBV-miR-3可通过sEVs和HBV病毒粒子释放到循环中，sEVs穿梭HBV-miR-3靶向HBV转录本的特定位点，特异性地降低HBc蛋白表达、PgRNA水平和HBV复制中间产物（HBV-RI）的生成，从而抑制HBV病毒粒子的复制［31-32］。进一步，sEVs释放的HBV-miR-3可刺激巨噬细胞M1极化，使细胞因子信号抑制因子5表达缺失从而激活JAK/STAT通路增强IFN诱导的抗HBV作用［33-34］。由此可见，sEVs中的HBV-miR-3通过减少肝细胞损伤，有助于治疗HBV持续感染患者的发展。

这些研究表明，在HBV感染中sEVs具有穿梭编码和非编码RNA和相关蛋白质的功能，这些活性分子物质不仅会促进病毒复制，同时也具有矛盾的另一面，抵抗病毒的增加。了解HBV相关sEVs包含的这些生物活性的核酸，将有助于研究HBV引起慢性感染的过程。

2.3 sEVs内含物蛋白质对HBV感染的影响 在HBV感染状态下，HBV抗原激发细胞外基质成分和相关因子的产生，它们是一类具有广泛生物学活性的分子蛋白质，sEVs则是它们的关键传播者。例如：sEVs可通过激活模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），如Toll样受体3（Toll-like receptors 3，TLR3），从而增强T细胞活性产生IL-17A而加剧肝脏疾病的发展，致肝星状细胞从静止状态激活启动纤维化阶段［35-36］。sEVs介导的IFN诱导的跨膜蛋白2，一种作用于Ⅰ型IFN信号的上游的负调控因子，从肝细胞向树突状细胞的运输增强了IFITM2对内源性IFN-α合成的抑制作用，从而阻断了外源性干扰素的抗乙型肝炎病毒的疗效［37］。然而，在肝非实质细胞中，IFN-α诱导的sEVs却富含具有抗病毒活性的分子，这些活性物质被肝细胞所内化后可以使机体抵御HBV病毒的入侵［38］。

这些研究表明，sEVs具有丰富的蛋白质成分，无论是大分子蛋白质如TLR3，还是小分子蛋白质如IFN-α等，在HBV感染的过程中sEVs携带的蛋白质对细胞均具有一定的调控作用，这种调控作用具有双向性，既可以促进疾病的发生，也可以防止病毒的入侵。

3 sEVs在HBV感染中的临床潜在应用

在HBV感染中，sEVs是极其复杂的独立结构，其所携带的物质会促进病毒适应动态的微环境变化，导致HBV感染过程中促炎和抗炎作用的失衡，从而造成机体的损伤或抗病毒反应。同时sEVs也可成为检测疾病的诊断和治疗方法。

3.1 sEVs可作为HBV感染的生物标志物 HBV感染与肝脏疾病的发生密切相关，虽然现在有很多检测肝炎及相关并发症的诊断方法，但对于它们的早期诊断却不具有准确性。临床上现有的生化标志物存在一定的局限性，且不能准确反映肝炎情况。sEVs由于具有稳定性、可用性以及在体液中广泛分布等优势，在肝炎疾病的辅助诊断中具有重要价值，并可能成为诊断不同严重程度的乙型肝炎的新生物标志物［39］。有研究表明，sEVs所携带的mi-RNA，如miR-122和miR-151，比ALT能更稳定和敏感地反映肝脏炎症活动［40］。在90%以上感染HBV的肝癌患者中，发现血清中sEVs携带的miR-21和miR-17-5p等具有高度的敏感性和特异性，sEVs携带的miR-21标记效果要比血清miR-21更好［41-42］。此外，sEVs所携带的lncRNAs在HBV感染中也起着重要作用，如HAR1A、HAR1B和HOTAIR表达的变化可能表明它们通过CoREST/REST复合物参与了HBV基因的表观遗传抑制，在感染的预后中起重要作用，循环HOTTIP在HBV患者中表达增加，可作为一种治疗和鉴定因子［43-44］。

虽然已有大量研究证实sEVs可作为HBV感染的辅助诊断工具，但其不确定性也有很多，例如sEVs的储存困难，HCC患者的血清中也上调miR-122生物标志物，lncRNA的HOTAIR因子可促进胃癌的发生，进一步表明sEVs的miRNA和lncRNA缺乏一定的特异性［45-46］。尽管如此，sEVs在HBV感染中的价值是我们不可忽视的，阐明sEVs中miRNA和lncRNA与HBV之间的关系，将有助于我们了解HBV感染。

3.2 sEVs可作为HBV感染的新的治疗方法 目前只有核苷酸类似物和PEG-IFN这两种HBV治疗方法，但易造成耐药性和HBV反弹［47-48］。sEVs由于其自身的特异性结构和属性，可作为纳米穿孔技术的研究用于治疗性蛋白质和抗病毒药物的载体［49-51］。有研究发现，在小鼠体内有一种未经修饰的sEVs作为重组HBV抗原佐剂的疫苗可以诱导Th1细胞的免疫应答，从而提高IFN-γ的水平，CD4+T细胞释放的sEVs可以活化B细胞反应从而提高HBsAg疫苗的疗效，虽然这些研究还处于早期阶段，需要进一步的研究来确定治疗靶点，但与传统疫苗相比，它更容易制备和操作，同时具有一定的安全性、可用性、稳定性和耐用性［52-54］。来自DEXs（树突状细胞的sEVs）制备的疫苗已应用于Ⅰ期临床试验中，同时评估了其可行性和安全性［55-56］。因此表明，sEVs将来可作为针对HBV的候选疫苗。

4 讨论

sEVs从代谢废物一跃成为人们争先恐后研究的“宠儿”，因其本身结构的异质性和特殊性，在病理微环境，信号传导和调节炎症反应中发挥重要的媒介作用。随着研究的深入，sEVs在HBV感染中作用逐渐被揭示，其不仅与HBV的感染具有密切的关系，而且是HBV生命周期的关键调控者。尽管在HBV感染的诊断和治疗方面仍然存在很多困难，并且对HBV病毒挟持sEVs进行传播和调控机体的感染机制也不是完全明了，但sEVs作为HBV 感染的新生物标志物和诊疗手段未来可期。深入研究这些纳米级的微小颗粒物质在HBV感染性疾病中的作用，有助于临床上HBV感染的诊断和治愈。