微小RNA与重症肌无力关系的研究进展

王钦 徐勇 武星星 魏玉惠 王云甫 （湖北医药学院附属太和医院，十堰 442000）

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种累及神经肌肉接头处的由抗乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR）抗体介导、CD4+T细胞依赖的自身免疫性疾病，表现为肌肉病态疲劳和无力，目前其发病机制尚未完全阐明［1］。miRNA是一类小分子非编码RNA，在免疫应答的调节中发挥重要作用，其参与调控CD4+T细胞的分化和功能，与多种自身免疫性疾病有关［2-3］。现有研究表明MG患者体内存在多种miRNAs表达异常，miRNA可能在MG的发生发展中发挥重要作用，可能是MG有效的生物标志物。有研究者以miRNA为治疗靶点明显改善了患者实验性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）症状。本文现就miRNAs与MG的关系进行综述，以期对MG的诊断及治疗策略提供新的思路。

1 miRNA概述

miRNA是一类长18～25 nt的内源性单链非编码RNA，起源于细胞核，在免疫应答过程中，miRNAs在调节免疫细胞的发育和分化方面具有关键作用。miRNA首先在细胞核内被RNA聚合酶Ⅱ转录成初始miRNA（primary miRNA，pri-miRNA），再由一种核糖核酸酶ⅢDrosha酶剪切，形成60～70 nt的发夹样结构前体（pre-miRNA）。Pre-miRNA再通过蛋白Exportin5和G蛋白因子Ran（Ran-GTP）转移至胞质，与Dicer酶（一种核糖核酸酶Ⅲ）结合并被其加工形成成熟的双链miRNA。然后其一条链被迅速降解，另一条链与Dicer酶、Argonaute蛋白等生物大分子装配形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）［4］。miRNA基于碱基互补配对原则与靶mRNAs的3'端非翻译区（3' untranslated region，3'UTR）中的特定序列结合，指导RISC抑制靶mRNA的翻译，或诱导靶mRNA降解，从而影响基因表达的微调、蛋白质的合成和细胞信号通路的调节。

2 miRNA与MG的相关性

MG作为一种自身免疫性疾病，存在基于表观遗传、环境因素相互作用的致病机制。miRNA是基因表达最重要的表观遗传调控因子之一，对各种生理和病理过程的调控至关重要，其与MG的关系引起许多学者的关注与思考［5-6］。

BARZAGO等［7］采用全转录组测序方法比较了抗AChR抗体阳性早发型重症肌无力患者（early onset myasthenia gravis，EOMG）和健康对照者外周血单个核细胞的转录水平，发现AChR-EOMG患者有11种pre-miRNAs差异表达，其中miR-612、miR-3654和miR-3651表达上调。SABRE等［8］对比了4例未经免疫抑制治疗的迟发型MG患者（late onset myasthenia gravis，LOMG）和4例健康对照者的外周血miRNA，在LOMG中发现miR-106b-3p、miR-30e-5p、miR-223-5p、miR-140-5p、miR-19b-3p水平明显升高。CRON等［9］通过miRNA基因组分析发现特定的胸腺miRNAs可能与MG相关。在肌肉特异性酪氨酸激酶抗体阳性的MG患者中也发现存在miRNAs水平异常，miR-423-5p、let-7d-3p、miR-409-3等表达上调，而miR-25-3p、miR-140-3p表达下调［10］。这些研究表明MG中存在多种miRNAs异常表达。

MG是一种免疫耐受障碍导致的自身免疫性疾病，有研究报道在MG中Th17细胞数量增多，Treg细胞亚群减少［11-12］。Th17细胞参与B细胞产生抗原特异性抗体的过程，与MG神经肌肉接头处的慢性炎症有关［13］。Treg细胞参与免疫耐受和免疫稳态的维持，在MG患者中，免疫耐受障碍被认为与Treg细胞功能障碍有关。Th17细胞和Treg细胞失衡被认为是MG免疫发病机制的主要驱动因素［14］。miRNA是一种重要的转录后调节因子，许多研究表明miRNA在病理生理条件下对调节CD4+T细胞的分化和功能具有重要作用［15-17］。

WANG等［18］在EAMG大鼠模型中发现miR-145表达显著下调，其靶蛋白CD28、NFATc1过表达，从而促进了Th17细胞分化。CRON等［19］发现在 EAMG小鼠模型中Th17细胞增多可能与miR-29表达减少有关。叉状头转录因子Foxp3是Treg细胞生成及行使免疫抑制功能的关键性转录调节因子，其下调可导致Treg细胞功能丧失。LI等［20］在伴胸腺瘤的MG患者中检测到miR-125a-5p高表达，并与Foxp3 mRNA的表达呈负相关。随后进一步证实Foxp3是miR-125a-5p的靶点，miR-125a-5p可下调Foxp3表达，表明miR-125a-5p可能通过影响Foxp3表达参与胸腺相关MG的发病。以上研究表明miRNA可能通过影响Th17及Tregs在MG的发生中发挥作用。

3 miRNA与MG的诊断

MG作为一种抗体介导的自身免疫性疾病，其诊断标准已经明确，但尚缺可靠的反映疾病进展的生物标志物及可能更好地支持治疗进展的药效学生物标志物。血清抗体有助于明确诊断，但抗体滴度不一定与患者的疾病进展或治疗反应相关。临床肌肉疲劳的客观测量容易出现波动，可能受对症治疗的影响，胸腺病理评估也不适合随时间追踪病程。

循环中的miRNAs在体液（尿液、血液等）中具有高度稳定性，在某些癌症中已将循环中的miRNAs用作生物标志物和诊断工具［21］。miRNA可能是一种非常有潜力的MG生物标志物。PUNGA等［22］采用逆转录定量（qRT-PCR）方法检测71例MG患者和55例健康对照者及23例自身免疫性疾病（Addison病、Crohn病和银屑病）患者血清中miR-150-5p和miR-21-5p的表达水平，发现MG患者血清中miR-150-5p和miR-21-5p水平高于健康对照者，而在自身免疫性疾病患者组中，miR-150-5p和miR-21-5p水平与健康对照组者相当，表明miR-150-5p和miR-21-5p在MG中具有特异性。SABRE等［8］对4例LOMG患者和4例健康对照的发现队列和73例LOMG患者的前瞻性诊断验证队列中的循环miRNA进行评估，并进行了纵向随访，发现miR-150-5p、miR-21-5p和miR-30e-5p的水平在免疫抑制治疗开始后随着临床的改善而降低，其水平与临床MG的严重程度呈正相关。XU等［23］发现miR-106a-5p在MG中表达下调，且在不同类型的MG中表达不同，其与MG的严重程度相关。CAVALCANTE等［24］对40例免疫抑制治疗有效和无效的意大利MG患者的外周血进行miRNome全序列测定，然后用实时PCR验证miRNAs，鉴定出41个miRNAs在治疗无效MG患者与治疗有效MG患者中存在表达差异，验证时发现miR-323b-3p、miR-409-3p和miR-485-3p在无效组中与有效组相比显著降低，miR-181D-5p和miR-340-3p呈相反趋势。随后作者在免疫抑制治疗有效和无效的以色列MG患者中（n=33）进一步分析发现，miR-323b-3p、miR-409-3p、miR-485-3p、miR-181D-5p和miR-340-3p可作为检验药物疗效的生物标志物。

4 miRNA与MG的治疗

目前MG的治疗主要以MG亚型为基础，包括使用乙酰胆碱酯酶抑制剂的对症治疗、胸腺切除术和免疫治疗及静脉注射免疫球蛋白和血浆置换等用于疾病恶化的快速治疗方法。这些治疗手段均不能有效防止疾病的复发与进展，而且在长期使用后存在感染、股骨头坏死等严重并发症，并且仍有10%的MG患者难以治疗［25］。开辟新的能够抑制免疫病理变化，阻断MG病情且副作用小的治疗途径是许多研究者的目标。

LIU等［26］发现在MG患者中miR-181a表达减少，其靶向细胞因子IL-2影响Th17细胞分化，随后他们用miR-181a治疗EAMG小鼠，发现miR-181a降低了Th17细胞比例，提高了Treg细胞比例，且抗AchR抗体水平降低，EAMG小鼠症状得到明显改善。此外，ZHANG等［27］使用抑制剂AntagomiR-146a沉默miR-146a有效改善了正在进行的EAMG小鼠的临床肌无力症状，WANG等［28］通过沉默miR-155降低了AChR特异性抗体，有效改善了EAMG症状。这些研究表明miRNA可能是治疗MG的潜在靶点，有望在未来推动MG的个性化治疗。

5 展望

MG作为一种常见的神经系统自身免疫性疾病，其免疫学发病机制及新型治疗途径的开辟备受关注。miRNA作为一种重要的转录后调节因子，在MG的发生发展中具有重要作用，某些miRNA也可能成为治疗MG的有效靶点，且检测体液中的miRNA可能有助于MG的诊断和监测。因此，研究可以从miRNA入手，聚焦于miRNA在MG免疫学发病机制中的作用，发掘miRNA中可能存在的治疗靶点和生物标志物，从而促进MG的临床分子诊断和个性化治疗。