香连止泻片对恶唑酮诱导溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用及其机制

田骄，王婷婷，2，徐意，苏芮，王晶

1 北京中医药大学中药学院，北京 102488；2 北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂；3 中药复方新药开发国家工程研究中心

溃疡性结肠炎（UC）是一种以腹痛、腹泻、便血以及里急后重等为主要特征的肠道慢性炎症性疾病［1］。UC 的病因目前尚不明确，可能是多种因素共同作用的结果，包括免疫因素、遗传因素和环境因素等［2］。有研究认为，Th1/Th2 免疫轴失衡在UC 的发生、发展中发挥重要作用，Th1/Th2 免疫轴失衡可导致肠道炎症加重，加速病情进展［3］。目前，UC主要采取药物治疗，如氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂等［4］。但这些药物长期大量使用对机体胃肠道的影响较大，易诱发多种不良反应［5］。中医学上并无“溃疡性结肠炎”这一病名，根据其临床特征，本病归属中医“痢疾”“泄泻”“便血”和“肠风”等范畴。中药能够通过抑制炎症反应及保护肠道黏膜等途径改善临床症状，不良反应相对较轻。香连止泻片原方出自清代沈金鳌《沈氏尊生书》中的“香连化滞丸”，具有清热祛湿、化滞止痢之功效。尽管已有研究证实，香连止泻片对UC具有较好的临床疗效［6-7］，但对其作用机制的研究报道较少。香连止泻片的主要成分有木香烃内酯［8］、小檗碱［9］、黄连粗多糖［9］、黄连总生物碱［10］、环氧橙皮油素［11］、白芍总苷［12］，这些成分能够有效改善UC小鼠结肠组织病理损伤，进而改善UC 症状。本课题组前期研究发现，香连止泻片对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导UC小鼠的治疗效果较好，可缓解其体质量减轻、稀便、血便及结肠长度缩短等症状或体征，并可修复结肠组织病理损伤［13］。但DSS价格昂贵，其诱导的炎症反应在动物个体间存在一定差异。恶唑酮为半抗原诱导剂，价格便宜，小鼠直肠给药后能够引起小鼠严重的便血、稀便等症状，同时还能诱导Th1/Th2 免疫轴失衡。2022 年8 月—12 月，本研究探讨了香连止泻片对恶唑酮诱导UC小鼠的治疗作用，并基于Th1/Th2免疫轴探讨了其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性BALB/c 小鼠48 只，SPF 级，8 周龄，体质量20～22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019-0010。所有小鼠于北京中研同仁堂医药研发有限公司动物房内饲养，自由摄食和饮水。饲养环境：温度（23.0 ±2.0）℃，相对湿度40%～70%，光照12 h/12 h明暗交替，正常通风。本研究经北京中研同仁堂医药研发有限公司动物伦理委员会审查（伦理审查编号：YJY-2022-082301）。香连止泻片，购自北京同仁堂科技发展股份有限公司。香连止泻片研磨粉碎，溶解于超纯水中，使其终浓度为10 mg/mL，按体表面积折算法换算，香连止泻片中剂量为临床等效剂量，香连止泻片高、低剂量分别为临床等效剂量的2、1/2倍。美沙拉嗪缓释颗粒，购自上海爱的发制药有限公司。美沙拉嗪缓释颗粒用羧甲基纤维素钠溶解，使其终浓度为2 mg/mL，按体表面积折算法换算，美沙拉嗪给药剂量为临床等效剂量。恶唑酮，购自美国BioLegend 公司。流式细胞仪，购自美国Agilent公司；酶标仪，购自美国BioTek 公司。TNF-α、IL-1β ELISA 试剂盒，IFN-γ、IL-4 一抗，HRP 标记亲和纯化山羊抗兔IgG 二抗，APC anti-mouse IFN-γ 抗体、PE anti-mouse IL-4 抗体、PerCP anti-mouse CD4 抗体，购自美国BioLegend公司。

1.2 动物分组与干预 所有BALB/c 小鼠适应性饲养1 周，按随机数字表法随机分为空白组、模型组、美沙拉嗪组以及香连止泻低、中、高剂量组，每组8 只。模型组、美沙拉嗪组以及香连止泻低、中、高剂量组采用恶唑酮诱导UC 模型［14］。空白组正常饲养，不予恶唑酮诱导UC 模型。自建模第1 天开始，美沙拉嗪组予美沙拉嗪0.31 g/kg 灌胃，香连止泻低、中、高剂量组分别予香连止泻片0.68、1.36、2.72g/kg 灌胃，空白组和模型组予等量超纯水灌胃，连续灌胃7天。

1.3 疾病活动指数（DAI）评估 灌胃期间，每日评估DAI。DAI评分标准：0分，体质量不变，大便正常；1 分，体质量下降＜5%，轻微稀便，轻微血便；2 分，体质量下降5%～＜10%，少量稀便，少量血便；3 分，体质量下降10%～＜15%，大量稀便，大量血便；4分，体质量下降≥15%，严重腹泻，血液充满整个结肠。DAI评分=（体质量下降评分+大便性状评分+血便评分）/3。

1.4 结肠长度测量和脾脏指数计算 末次灌胃结束，称量小鼠体质量。麻醉后剪开腹腔，分离脾脏并称质量，计算脾脏指数。脾脏指数=脾脏质量/体质量。分离结肠，测量整段结肠长度。

1.5 结肠组织病理形态观察 取小鼠结肠组织，用生理盐水冲洗肠内容物，去除黏膜表面的粪便和分泌物，截取同一位置病变结肠或正常结肠，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，组织切片。切片常规脱蜡至水，高碘酸溶液氧化，Schiff染色，苏木素染核，常规脱水透明，中性树胶封固。显微镜下观察结肠组织病理形态变化，计数结肠黏膜杯状细胞数量。

1.6 结肠组织IL-1β、TNF-α 含量检测 取部分结肠组织，置于冰上匀浆，4 ℃下5 000 r/min 离心20 min、离心半径10 cm，留取上清液。采用ELISA法检测结肠组织上清液IL-1β、TNF-α含量。

1.7 结肠组织IFN-γ、IL-4 蛋白表达检测 每组取3 只小鼠结肠组织，剪碎，加入组织裂解液冰上充分裂解，提取组织总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。加入5 × 蛋白上样缓冲液，100 ℃沸水浴充分变性。取部分变性蛋白，SDS-PAGE分离。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至NC 膜上。5% BSA 室温封闭1 h，分别加入IFN-γ、IL-4、β-actin一抗（稀释比均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜。次日，加入HRP 标记亲和纯化山羊抗兔IgG 二抗（稀释比1∶2 000），室温孵育1 h。ECL 发光，暗室内曝光、显影、定影。采用Image J 软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目标蛋白相对表达量。

1.8 Th1、Th2 细胞比例检测 末次灌胃结束，将小鼠麻醉后取血，置于含EDTA 的离心管中，用PBS 将抗凝血液稀释一倍，轻轻混匀。向离心管中加入3 mL 淋巴细胞分离液，将稀释的血液平铺在淋巴细胞分离液上层，室温下低速离心，吸出淋巴细胞层，离心收集细胞，RPMI 1640 完全培养基重悬，加入Human TruStain FcX™室温孵育10 min。收集细胞，加入CD4 抗体室温避光孵育15 min，细胞固定液室温避光固定，细胞破膜液破膜，分别加入IFN-γ、IL-4抗体室温避光孵育30 min，上机检测，分析Th1 细胞和Th2细胞的比例，计算Th1/Th2。

1.9 统计学方法 采用SAS8.2统计软件。计量资料经Shapiro-Wilk 正态性检验符合正态分布且方差齐性，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后多重比较采用LSD-t检验；两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间DAI评分比较 见表1。

表1 各组不同时间DAI评分比较（± s）

表1 各组不同时间DAI评分比较（± s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与香连止泻低剂量组比较，△P＜0.05。

?

2.2 各组结肠长度和脾脏指数比较 见表2。

表2 各组结肠长度和脾脏指数比较（± s）

表2 各组结肠长度和脾脏指数比较（± s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与美沙拉嗪组比较，△P＜0.05；与香连止泻中剂量组比较，▲P＜0.05。

?

2.3 各组结肠组织病理形态观察和结肠黏膜杯状细胞数量比较 空白组结肠黏膜上皮完整，黏膜杯状细胞排列规则，形态完整，数量正常，无空泡，内含糖原物质正常；与空白组比较，模型组结肠黏膜上皮不完整，黏膜杯状细胞排列不规则，数量减少，顶部呈空泡状，内含糖原物质减少；与模型组比较，香连止泻低、中、高剂量组和美沙拉嗪组结肠黏膜上皮完整，黏膜杯状细胞排列规则，形态完整，数量正常，顶部部分呈空泡状，内含糖原物质趋于正常。空白组、模型组、美沙拉嗪组及香连止泻低、中、高剂量组结肠黏膜杯状细胞数量分别为（172.75 ± 15.37）、（47.50 ± 5.29）、（159.18 ± 20.61）、（86.85 ± 8.37）、（103.75 ± 9.57）、（135.66 ± 12.50）个。与空白组比较，模型组结肠黏膜杯状细胞数量显著减少（P＜0.05）；与模型组比较，美沙拉嗪组及香连止泻低、中、高剂量组结肠黏膜杯状细胞数量均显著增加（P均＜0.05），以美沙拉嗪组和香连止泻高剂量组杯状细胞数量增加较为明显，几乎趋近于空白组。

2.4 各组结肠组织TNF-α、IL-1β含量比较 见表3。

表3 各组结肠组织TNF-α、IL-1β含量比较（pg/mg，± s）

表3 各组结肠组织TNF-α、IL-1β含量比较（pg/mg，± s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与美沙拉嗪组比较，△P＜0.05；与香连止泻低剂量组比较，▲P＜0.05。

?

2.5 各组结肠组织IL-4、IFN-γ蛋白表达比较 见表4。

表4 各组结肠组织IL-4、IFN-γ蛋白相对表达量比较（± s）

表4 各组结肠组织IL-4、IFN-γ蛋白相对表达量比较（± s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

?

2.6 各组全血Th1、Th2 细胞比例及Th1/Th2 比较 见表5。

表5 各组全血Th1、Th2细胞比例及Th1/Th2比较（± s）

表5 各组全血Th1、Th2细胞比例及Th1/Th2比较（± s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与美沙拉嗪组比较，△P＜0.05；与香连止泻低剂量组比较，▲P＜0.05；与香连止泻中剂量组比较，▽P＜0.05。

?

3 讨论

近年来，我国UC患病例数逐渐增多，患病人群呈年轻化趋势，多见于20～40岁人群。UC病情轻重不等，多呈反复发作的慢性病程，并且随着病程延长，其癌变概率逐渐升高。UC 不仅会严重影响患者生活质量，还会给患者和家庭带来沉重的经济负担［15］。

中医学认为，外感湿邪、饮食不洁、情志内伤等是UC 病情加重的主要原因，而肠道湿热、气滞不通则为其基本病机。香连止泻片原方出自清代沈金鳌《沈氏尊生书》中的“香连化滞丸”，具有清热祛湿、化滞止痢之功效，主要用于治疗肠中蕴热引起的红白痢疾。研究发现，香连止泻片的主要有效成分能够不同程度改善UC 症状。例如，木香烃内酯可改善UC 小鼠肠道菌群状态，调节Th1/Th2 免疫轴平衡［8］；黄连粗多糖联合小檗碱对UC 小鼠肠黏膜屏障具有保护作用［9］，黄连总生物碱对UC 大鼠肠黏膜损伤具有明显抑制作用［10］，环氧橙皮油素可降低UC小鼠结肠黏膜损伤指数以及结肠组织TNF-α 含量［11］，白芍总苷可减少UC 大鼠结肠组织TNF-α、PGE2等炎症因子表达［12］。尽管已有研究证实，香连止泻片对UC 具有较好的临床疗效［6-7］，但对其具体作用机制的研究报道较少。

本研究采用恶唑酮诱导UC小鼠模型，探索了香连止泻片对UC小鼠的治疗作用，并基于Th1/Th2免疫轴探讨了其作用机制。本研究首先通过DAI评分初步评估了UC 小鼠疾病严重程度，结果发现，模型组各时间DAI评分均显著高于空白组；香连止泻各剂量组和美沙拉嗪组在灌胃给药3 天后DAI 评分开始显著降低。UC模型动物因持续腹泻和便血，会导致结肠长度缩短。脾脏是机体重要的免疫器官，而脾脏指数能够在一定程度上反映机体免疫功能和炎症反应程度。本研究结果发现，模型组结肠长度显著小于空白组，脾脏指数显著高于空白组；香连止泻高、低剂量组和美沙拉嗪组则能显著抑制UC小鼠结肠长度缩短，香连止泻高、中剂量组和美沙拉嗪组则能显著降低脾脏指数，从而改善小鼠结肠炎症状态。本研究PAS染色进一步观察了结肠组织病理形态变化和结肠黏膜杯状细胞数量及其分泌状况，结果发现，模型组结肠组织病理损伤明显，结肠黏膜上皮破裂，内含糖原物质明显减少，结肠黏膜杯状细胞数量显著降低；香连止泻各剂量组和美沙拉嗪组结肠组织病理损伤减轻，杯状细胞排列较规则，形态较完整，内含糖原物质基本趋于正常，杯状细胞数量显著增多，从结肠组织病理学角度上进一步印证了香连止泻片治疗UC的有效性。Th1、Th2细胞由CD4+T细胞分化而来，正常情况下机体中Th1/Th2免疫轴处于平衡状态。Th1/Th2 免疫轴失衡会导致CD4+T 细胞过度活化，从而促进肠道炎症进展［16］。Th1细胞可分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2等，具有促炎作用。IFN-γ能够重新激活CD4+T细胞向Th1细胞分化，从而参与细胞免疫反应。Th2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-10等，具有抑炎作用。IL-4可使CD4+T细胞向Th2细胞分化，活化B 细胞，从而介导体液免疫和超敏反应［17］。作为UC 患者体内重要的促炎因子，TNF-α 可诱导趋化因子，激活肠道上皮细胞，使肠道中性粒细胞聚集，从而促进UC的发生、发展。TNF-α还可损伤结肠血管内皮细胞，使血管通透性增加，进一步引起结肠黏膜损伤［18］。促炎因子IL-1β在UC的病理生理过程中扮演重要角色。UC患者结肠黏膜中分泌大量IL-1β，促进中性粒细胞浸润，进而刺激肠道黏膜，加重肠道炎症反应。本研究结果发现，模型组结肠组织TNF-α、IL-1β 含量显著高于空白组，提示UC 小鼠肠道炎症反应明显。同时，模型组结肠组织IFN-γ蛋白表达以及全血Th1细胞比例和Th1/Th2均显著高于空白组，结肠组织IL-4蛋白表达和全血Th2 细胞比例显著低于空白组，提示UC模型小鼠Th1/Th2免疫轴处于失衡状态，肠道黏膜出现明显炎症。与模型组比较，香连止泻各剂量组和美沙拉嗪组均能降低结肠组织TNF-α、IL-1β含量及IFN-γ蛋白表达，提高IL-4蛋白表达，降低Th1 细胞比例和Th1/Th2，提高Th2 细胞比例，纠正Th1/Th2免疫轴的失衡状态。本研究以美沙拉嗪作为阳性对照药物，其主要成分是5-氨基水杨酸，临床主要用于治疗UC。本研究结果显示，与美沙拉嗪组比较，香连止泻各剂量组在部分指标上展现出了更好的效果。例如，香连止泻中剂量组能够显著降低结肠组织IFN-γ蛋白表达；香连止泻中、高剂量组降低Th1细胞比例的效果优于美沙拉嗪组；香连止泻低剂量组升高Th2细胞比例的效果优于美沙拉嗪组。

综上所述，不同剂量香连止泻片对恶唑酮诱导UC小鼠均有一定治疗作用，以香连止泻片高剂量（2倍的临床等效剂量）效果最佳；纠正Th1/Th2免疫轴失衡，减轻肠道炎症，可能是香连止泻片的作用机制之一。