溃疡性结肠炎动物模型构建方法的研究进展

田家华，索小涛，马晨曦，郑丽红，王海强

1 黑龙江中医药大学附属第一医院消化二科，哈尔滨 150040；2 黑龙江中医药大学附属第四医院消化内科

溃疡性结肠炎（UC）是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，病理改变主要累及结肠或直肠的黏膜层和黏膜下层，临床表现为黏液脓血便、间断性腹泻、腹痛、里急后重等。有研究表明，UC可增加自身免疫性肝病、结直肠癌、贫血等疾病的发生风险，并可引起焦虑、抑郁等精神心理疾病，给患者造成沉重的经济负担和巨大的心理压力［1-3］。目前，UC的确切发病机制尚不完全清楚，可能与肠道微生态失衡、自身免疫功能紊乱以及家族遗传等因素有关［4］。UC诊断尚无金标准，主要结合临床表现、影像学检查、结肠镜检查及肠组织病理检查等综合分析。但UC 病程往往较长，病情迁延难愈，缓解期与活动期交替出现，病例收集和随访难度较大。UC动物模型可模拟UC肠黏膜屏障损伤、肠道炎症状态及菌群紊乱情况。因此，通过构建合理的动物模型对揭示UC的发病机制、探索高效的治疗策略至关重要。目前，UC动物模型的构建方法主要有诱导法、基因敲除法和联合法，这些模型构建方法各有利弊，应根据自身实验需求和实验条件选择最适合的动物模型。本文结合文献就UC动物模型构建方法的研究进展作一综述。

1 诱导法构建UC动物模型

诱导法是UC 动物模型最常见的建模方法，通常采取口服、灌胃、灌肠三种方式经消化道给药，部分化学药物还可采取经腹腔注射方式给药。诱导法的成本相对较低，对实验室硬件要求较低，并且建模成功率较为理想。但诱导法对给药时间、药物浓度及动物敏感性等要求较高，部分诱导药物的毒性较强，易造成动物死亡。根据诱导剂不同，诱导法可分为化学药物诱导法、微生物诱导法和食物诱导法。诱导法UC 动物模型的诱导药物、给药方式、常用动物、建模周期及模型评价见表1。

表1 诱导法UC模型的诱导药物、给药方式、常用动物、建模周期及模型评价

1.1 化学药物诱导法 化学药物诱导法是通过化学药物、抗原或抗体制剂等破坏肠黏膜屏障并诱导结肠炎症，是最经典且最常用的UC 动物模型构建方法。最常用的化学药物为葡聚糖硫酸钠（DSS），其次为三硝基苯磺酸（TNBS）和乙酸。此外，还有一些使用频次较低的化学药物，如二硝基苯胺磺酸（DNBS）、恶唑酮（OXA）、吲哚美辛等。通过DSS 构建UC 动物模型简单易行，成功率高，可重复性强，可模拟UC 急性和慢性炎症过程。通过TNBS 构建UC动物模型，低剂量时炎症维持时间较短且存在自愈倾向，而高剂量时则易引起动物死亡。但该模型构建方法可通过调整药物剂量模拟UC 活动期与缓解期交替的临床状态。乙酸构建UC 动物模型周期短，药效持续时间有限，仅可诱导UC 急性炎症过程。DNBS 的药理特征与TNBS 类似，但需配合乙酸使用，建模较复杂，近年越来越少通过DNBS 构建UC 动物模型。OXA 与DNBS 同为半抗原，无法单独应用，需预先配合乙醇致敏，通过OXA 构建UC 动物模型亦逐年减少。吲哚美辛可抑制肠黏膜中前列腺素合成，进而损伤肠黏膜屏障，但该药制备时操作繁琐，并且损伤部位更趋向于小肠，近年已逐渐被弃用。化学药物诱导法一般需要先将实验动物置于光照12 h/黑暗12 h交替、适宜的温度和湿度环境下适应性饲养1 周，然后制备相应浓度的化学药物进行口服、灌胃、灌肠或腹腔注射。根据模拟的临床分期不同，化学药物诱导法建模所需时间由1 周至数月不等［5］。各化学药物的作用机制有所不同，DSS 和乙酸可直接作用于消化道黏膜层及黏膜下层，通过破坏消化道物理屏障的紧密连接结构，为致病菌鞭毛、脂多糖等有毒物质侵袭结肠组织创造条件，还可影响TNF-α、IL-6 分泌，进而破坏炎症因子平衡；TNBS、DNBS、OXA则作为抗原通过诱发免疫炎症反应，模拟UC 患者的肠组织病理变化；吲哚美辛是一种非甾体抗炎药，可抑制维持肠黏膜屏障的前列腺素分泌，进而造成肠黏膜屏障破坏和肠道炎症。化学药物诱导法的适用范围较广，既可用于免疫相关性研究，又可用于肠黏膜屏障相关性研究。化学药物诱导法的建模动物包括小鼠、大鼠、犬、家兔等，建模难度较低，建模成功率高，但由于其主要通过消化道给药，能够直接破坏肠黏膜屏障并诱发免疫应答，部分药物可能还会诱发肠外症状，如TNBS 对皮下组织的腐蚀性较强，可影响实验结果的准确性。尽管目前已有学者提出了实验动物用药剂量换算公式，但在实际应用中，化学药物诱导法构建UC 动物模型过程中仍存在用药剂量混乱情况，从而对模型构建成功率造成一定影响。

1.2 微生物诱导法 肠道菌群是指肠道内的微生物，对维持肠道正常功能具有重要作用［6］。正常情况下，肠道菌群可与宿主及外部环境建立起动态平衡，一旦肠道菌群紊乱，即可引起宿主多种功能丧失，如黏膜屏障功能丧失、炎症和免疫功能丧失等，从而诱发多种疾病［7］。当前，肠道菌群与UC 发病的关系尚未完全明确，但普遍认为益生菌作为优势菌群可抑制致病菌繁殖，同时提供营养物质维护肠黏膜屏障，避免肠道炎症发生［8］。厚壁菌门及拟杆菌门的主要代谢产物短链脂肪酸可为结肠上皮细胞提供60%～70%的能量，是维护肠黏膜屏障的重要能量来源。而梭状芽孢菌、类杆菌等与UC 发生和病情加重密切相关，在UC 活动期患者肠道中此类菌群丰度明显增加［9-10］。微生物诱导法是通过灌胃或灌肠方式使致病菌定植于结肠处，从而诱发UC相关症状的模型构建方法。微生物诱导法包括从UC 患者粪便中提取致病菌移植诱导和使用单一菌株移植诱导两种。微生物诱导法普遍适用于各类实验鼠，可模拟UC 患者的肠道菌群结构。学者们大多选择移植UC患者肠道菌群来构建其动物模型，建模成功率较高，但出现动物死亡的概率较大，而单一菌株移植建模成功率尚不确定［11］。微生物诱导法构建UC 动物模型存在较大的不确定性，难以明确诱发UC的具体菌属，故该建模方法有待于进一步优化。

1.3 食物诱导法 特定的饮食习惯与UC 发生有一定相关性。有研究认为，膳食纤维摄入减少和肉类、蛋类以及乳制品类食物摄入增多是当前UC发病率不断增长的主要原因［12-15］。食物诱导法是通过高糖高脂饮食和增加乙醇摄入量等诱导肠黏膜屏障损伤的UC 动物模型构建方法。THOMAS 等［16］使用麦芽糖混合猪油制作高脂饲料，小鼠自由进食该高脂饲料6周，第6周末予3% DSS，成功构建出UC动物模型。LI等［17］每日将SD大鼠置于湿热环境中6 h，实验全程予蜂蜜水、猪油喂养，从第3周起每日灌胃高度白酒，成功模拟出热带沿海人群的UC动物模型。该方法构建的UC动物模型较贴近临床实际情况，可探索饮食结构与UC 发病的相关性。但由于饲养环境和特定食物制备等问题，该模型构建方法主要适用于小型实验动物，如BALB/c 小鼠、C57BL/6 小鼠、Swiss小鼠。食物诱导法构建UC 动物模型的成功率较低，并且不能单独构建UC 动物模型，通常需要联合其他UC动物模型构建方法［12］。

2 基因敲除法构建UC动物模型

全基因组关联研究发现了不少可能与UC 相关染色体上的易感区域及易感基因［18］。基因敲除是20 世纪80 年代末发展起来的一种新型分子生物学技术，是使生物体基因组中的特定基因失活或失效的过程。近年来，修改实验动物特定基因片段以实现免疫应答或屏障功能失常成为构建UC 动物模型的新手段。基因敲除法构建的动物模型为进一步探索基因异常所致自发性UC 的发病机制提供了可能。根据敲除基因不同，基因敲除法可分为屏障蛋白基因敲除法和抗炎因子基因敲除法。

2.1 屏障蛋白基因敲除法 在UC 发生、发展过程中，肠黏膜屏障结构和功能的维持对机体免疫环境稳态至关重要［19］。屏障蛋白基因敲除法UC 动物模型是通过敲除构成结肠黏膜屏障的蛋白，以构建自发性UC 动物模型。肠黏膜屏障损伤后，其通透性增加，肠道细菌、内毒素、炎症介质等可通过受损的肠黏膜屏障进入内环境，诱发和（或）加重炎症反应，从而导致UC 的发生、发展。基因敲除常选择的屏障蛋白包括带状闭合蛋白、咬合蛋白、闭合蛋白等，通过在靶基因中引入突变使其失去功能［20］。基因敲除方法有同源重组、RNA 干扰和CRISPR/Cas9。CRISPR/Cas9 是最常用的基因编辑工具，它使用引导RNA 和Cas9 酶在基因组的特定位置引入靶向DNA 断裂，从而导致基因破坏［21-22］。屏障蛋白基因敲除法构建UC 动物模型的成功率高，在实验过程中无自愈倾向，可完全模拟UC 的肠组织病理变化，并且损伤位置精准可控，适用于针对闭锁蛋白、Claudin 蛋白、膜周蛋白家族以及连接黏附分子等靶点的药物研发，也是未来构建UC 动物模型的主流方法。屏障蛋白基因敲除法理论上适用于所有实验动物，但由于基因工程技术难度大、成本高，该模型动物主要为小鼠。

2.2 抗炎因子基因敲除法 肠道内炎症平衡被破坏是UC 的发病机制之一［23］。抗炎因子基因敲除基于CRISPR/Cas9 基因技术平台，通过内切酶切割双链DNA 导致切割位点移码突变或片段缺失，造成基因沉默，功能丧失，从而实现基因敲除［24］；这一步骤完成后，炎症平衡被打破，促进了炎症反应，从而成功构建了UC 动物模型［25］。抗炎因子基因敲除法是UC动物模型中最适合研究发病机制的建模方法，同时也适用于自发性UC 高发人群的靶向药物研发。与屏障蛋白基因敲除法类似，该模型动物主要为小鼠，其原因一个是成本高，另一个是抗炎因子基因敲除后，炎症平衡被破坏，实验动物存在死亡风险。

3 联合法构建UC动物模型

联合法采取两种及以上方法构建UC 动物模型，常用于补充单一模型构建方法模拟UC 肠组织病理状态的不足。GE 等［11］通过化学药物联合微生物菌群构建的小鼠UC 动物模型，不仅能模拟肠道菌群失调状态，还能模拟肠道炎症状态，此外还解决了单一菌株建模成功率较低的问题。张泽丹等［26］通过化学药物联合特殊饮食并模拟特殊环境构建的小鼠UC 模型，能够模拟UC 患者真实的生活习惯，适用于特定地域或人群的UC 研究。联合法构建UC动物模型对实验动物品类要求较低，各品类实验鼠均可用于构建UC 动物模型。联合法构建UC 动物模型的根本目的在于进一步缩小实验室内模拟环境和临床实际的差异，可广泛用于发病机制的研究，但联合法并非多种模型构建方法的简单堆砌，需要科学合理的前期设计。

综上所述，UC是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，其确切发病机制尚不完全清楚。目前，UC诊断尚无金标准，主要结合临床表现、影像学检查、结肠镜检查及肠组织病理检查等综合分析。但UC病程往往较长，病情迁延难愈，缓解期与活动期交替出现，病例收集和随访难度较大。而UC动物模型可模拟UC肠黏膜屏障损伤、肠道炎症状态及菌群紊乱情况。因此，通过构建合理的动物模型对揭示UC的发病机制、探索高效的治疗策略至关重要。目前，UC动物模型的构建方法主要有诱导法、基因敲除法和联合法。这些模型构建方法各有利弊，应根据自身实验需求和实验条件选择最适合的动物模型。