二氢杨梅素与马铃薯淀粉的相互作用及抗氧化性的研究

钟晓瑜，杨志伟

（广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004）

二氢杨梅素（dihydromyricetin,DMY）又称显齿葡萄素,是一种从显齿蛇葡萄叶植物中发现的多酚类化合物。目前显齿蛇葡萄叶植物中藤茶所含DMY 单体含量最高[1]。研究发现藤茶中DMY 的含量高达35%,得率约为12.9%[2-3]。2013 年国家卫生计生委宣布显齿蛇葡萄叶可以作为新资源食品来开发利用[4]。DMY被验证具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗炎抑菌等多种功能活性[5-8]。

多酚与蛋白质、多糖、淀粉的相互作用机制以及功能特性是当前研究热点。研究表明多酚通过与淀粉发生氢键相互作用可达到抑制淀粉老化和消化的效果[9-10]。黎明明等[11]研究发现添加表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）的辛酰基琥珀酸（octenyl succinic anhydride,OSA）淀粉,提高了OSA 淀粉的抗氧化性。欧阳祝等[12]研究发现较柚皮苷单体而言,柚皮苷-寡糖复合物的抗氧化性和抑菌性显著提高。赵倩[13]研究发现较酪蛋白而言,基于氢键非共价作用结合的单宁酸-酪蛋白复合物、没食子酸-酪蛋白复合物的抗氧化性显著提高。

目前已有的研究报道主要关于DMY 在食品和生物等领域的加工应用,DMY 在淀粉基食品加工的研究鲜见。本文以DMY、马铃薯淀粉为主要原料,采用共糊化法制备DMY-马铃薯淀粉复合物,利用傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）、X 射线衍射（X-ray diffraction,XRD）、核磁共振氢谱仪（H nuclear magnetic resonance,1HNMR）与电镜扫描（scanning electron microscope,SEM）探究二者相互作用机理,通过DPPH 自由基、ABTS+自由基、羟基自由基清除率等抗氧化性指标研究二氢杨梅素-淀粉复合物的抗氧化性,探究多酚与淀粉发生相互作用后复合物的抗氧化性的变化,同时为具有保健功能的二氢杨梅素在功能性淀粉基食品中的扩展应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

马铃薯淀粉:固原雪冠淀粉有限责任公司；二氢杨梅素:贵州苗药生物技术有限公司；以2,2-联苯基-1-苦基肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH）、2,2′-氨基二（2-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐[2,2′-amino-di（2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt,ABTS）]、水杨酸、无水乙醇、硫酸亚铁、溴化钾（均为分析纯）:广东光华科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌恒温水浴锅（EMS-30）:常州爱华仪器制造有限公司；傅里叶转换红外光谱仪（Nicolet iS50）:美国赛默飞世尔科技公司；场发射扫描电子显微镜（QuattroPHS-3C）:日本理学公司；X-射线衍射仪（D/MAX）:上海仪电科学仪器股份有限公司；核磁共振仪氢谱仪（AVANCE III HD500）:德国布鲁克公司。

1.3 试验方法

1.3.1 二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物的制备

参考韩雪琴[14]的方法制备二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物。取淀粉7.2 g 于各锥形瓶中,分别加入占淀粉干基重0%、5%、10%、15% 的DMY,加入60 mL 蒸馏水,用保鲜膜做密封处理。置于磁力搅拌恒温水浴锅中温度95 ℃加热20 min 的条件下快速搅拌。加热后的样品冷却至室温,分装一部分样品放入-80 ℃冰箱速冻4 h 后冻干,剩余部分样品放入4 ℃冰箱贮存7 d 后冻干,所有样品过100 目筛,备用。

1.3.2 X 射线衍射仪测定

采用X-射线衍射仪对二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物、天然马铃薯淀粉、二氢杨梅素进行晶型扫描。试验条件:电压40 kV,电流40 mA,衍射角的旋转范围4°～40°,扫描速率4.0°/min,步长0.02°[14]。

1.3.3 红外光谱仪测定

采用傅里叶变换红外光谱仪对二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物、二氢杨梅素进行测定。待测样品与KBr 按质量比1∶150 混合充分后研磨压片制样,进行红外光谱扫描定性分析。测量范围4 000～400 cm-1,扫描次数32,扫描分辨率4 cm-1[15]。

1.3.4 核磁共振氢谱仪（1HNMR）测定

取一定质量的二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物、二氢杨梅素（<10 mg）,充分溶解于0.6 mL 的氘代二甲基亚砜中,然后将混合液转移至5 mm 核磁共振管中,进行核磁共振氢谱测定。扫描次数128、豫弛时间3 s[15]。

1.3.5 扫描电镜观察

将少量的样品粉末均匀分散在载物台的双面导电胶上,用洗耳球吹去多余样品,在真空条件下喷金处理后对样品的微观结构进行观察。试验条件:扫描电压5 kV,电流14.0µA,放大倍数为1 200、5 000 倍[14]。

1.3.6 DPPH 自由基清除率的测定

参考Rafiee 等[16]的方法测定复合物的DPPH 自由基清除率。取10 mg DPPH 固体粉末,用无水乙醇配成浓度为0.2 mmol/L 的DPPH 溶液,备用。分别取30 mg 不同添加量的二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物以及复合物中对应的二氢杨梅素单体分别与5 mL 无水乙醇混合,配成适合浓度的样品溶液,充分振荡混匀后备用。将样品溶液与DPPH 溶液等体积混合并摇匀,然后放置避光处常温水浴30 min,随后在517 nm 处测定吸光值。按公式（1）计算DPPH 自由基清除率。

式中:X为DPPH 自由基清除率,%；A0为DPPH 乙醇溶液在517 nm 处的吸光值；Ai为二氢杨梅素乙醇溶液、二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物乙醇溶液与DPPH自由基作用后吸光值；Aj为二氢杨梅素乙醇溶液、二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物乙醇溶液的吸光值。

1.3.7 ABTS+·清除率的测定

参考张静等[17]的方法测定二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物的ABTS+·清除率。将7 mmol/L ABTS 和2.4 mmol/L 过硫酸钾溶液按2∶1 比例混合,混合液在黑暗条件下反应12～16 h 产生ABTS+·,使用前用无水乙醇稀释至在734 nm 处的吸光值为0.70±0.02 即可,得到ABTS 工作液备用。分别取30 mg 不同添加量的二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物以及复合物中对应的二氢杨梅素单体质量分别与5 mL 无水乙醇混合,配制成适合浓度的样品溶液,备用。吸取合适浓度的待测样品1 mL 于试管中,每个试管加入4 mL ABTS 工作液,在30 ℃条件下避光反应6 min 后于734 nm 处测定其吸光值为A1,用无水乙醇代替样品为空白对照为A2。按公式（2）计算清除率。

式中:X为ABTS+·清除率,%；A1为1 mL 样品+4 mL ABTS 工作液在734 nm 处的吸光值；A2为1 mL无水乙醇+4 mL ABTS 工作液在734 nm 处的吸光值。

1.3.8 ·OH 清除率的测定

参考张静等[17]的方法测定复合物的·OH 清除率。配制6 mmol/L 硫酸亚铁溶液、6 mmol/L 双氧水溶液、6 mmol/L 水杨酸溶液,备用。分别取30 mg 不同添加量的二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物以及复合物中对应质量的二氢杨梅素单体分别与5 mL 无水乙醇混合,配制成适合浓度的样品溶液,备用。在反应体系中一次性加入1 mL 硫酸亚铁溶液、1 mL 的水杨酸溶液和1 mL 样品液和适量蒸馏水,混合均匀后加入1 mL 双氧水溶液开始反应,然后37 ℃水浴30 min,在510 nm波长处测定吸光值。按公式（3）计算清除率。

式中:X为·OH 清除率,%；A0为1 mL FeSO4+1 mL水杨酸+1 mL 蒸馏水+1 mL H2O2在510 nm 处的吸光值；Ai为1 mL FeSO4+1 mL 水杨酸+1 mL 样品溶液+1 mL H2O2在510 nm 处的吸光值；Aj为1 mL FeSO4+1 mL 水杨酸+1 mL 样品溶液+1 mL 蒸馏水在510 nm处的吸光值。

1.4 统计分析

试验数据均由3 次重复平行试验所得,用Origin绘图,用Spss19.0 软件Duncan 检验法进行显著性差异分析（P<0.05）,并以平均值±标准差的形式表示。

2 结果与讨论

2.1 X 射线衍射分析

多酚与淀粉相互作用的方式主要有以下两种:1）多酚与淀粉通过氢键、范德华力发生非共价作用；2）多酚可进入淀粉的螺旋疏水性空腔,与淀粉形成V 型复合物[18],在X 射线衍射图谱2θ为7.5°、12.7°、20.1°会有明显的衍射峰[19]。

图1 为二氢杨梅素的X-射线衍射图谱。

图1 二氢杨梅素的X-射线衍射图Fig.1 X-ray diffraction pattern of dihydromyricetin

由图1 可知,二氢杨梅素在10.32°、16.65°、17.80°、23.60°、25.39°、26.02°、27.13°、30.50°处具有显著的晶体衍射峰,这说明二氢杨梅素以晶体结构的形式存在,与文献中的结果一致[20]。

图2 为马铃薯淀粉-二氢杨梅素复合物的X-射线衍射图。

图2 马铃薯淀粉-二氢杨梅素复合物的X-射线衍射图Fig.2 X-ray diffraction pattern of potato starchdihydromyricetin complex

如图2 所示,天然马铃薯淀粉（potato starch,PS）显示一个典型的B 型XRD 衍射图谱,它在2θ约为17°、22°、24°有一个明显的峰强度[21]。未添加DMY 的马铃薯淀粉（PS+0%DMY）在2θ角约17°出现明显的信号峰,为B 型结晶体。当DMY 的添加量为5% 时,二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物的晶型为B 晶型。继续增大二氢杨梅素的添加量,2θ约17°的衍射峰强度减弱,2θ在16.6°、17.76°、25.50°、30.46°处出现较为明显的信号峰,这可能是二氢杨梅素的特征峰。综上所述,在共糊化过程中,二氢杨梅素没有进入淀粉螺旋空腔与之形成V 型复合物,由此推测二氢杨梅素通过氢键等非共价作用与淀粉结合。

2.2 红外光谱分析

红外光谱可依据在特定波长下出现的官能团的伸缩振动峰,对目标物质进行结构表征。

图3 为二氢杨梅素傅里叶红外光谱图。

图3 二氢杨梅素傅里叶红外光谱图Fig.3 Fourier infrared spectra of dihydromyricetin

由图3 可知,DMY 在3 350 cm-1出现宽而钝的强峰对应为羟基伸缩振动峰；在1 640 cm-1出现的强峰对应为碳基伸缩振动峰,在1 471 cm-1处的强峰是由于C C 的振动引起的；在1 155 cm-1处的强峰归因于—C—O—C—伸缩振动峰,这与文献报道的一致[22]。

为探究二氢杨梅素与马铃薯淀粉之间的相互作用,采用红外光谱仪探讨二氢杨梅素与马铃薯淀粉结合后马铃薯淀粉的结构变化。图4 为马铃薯淀粉-二氢杨梅素复合物傅里叶红外光谱图。

图4 马铃薯淀粉-二氢杨梅素复合物傅里叶红外光谱图Fig.4 Fourier infrared spectra of potato starch-dihydromyricetin complex

由图4 所示,所有样品在3 500～3 300 cm-1之间存在宽而钝的吸收峰,这是由于羟基拉伸振动和吸收造成的,2 929 cm-1是—CH 伸缩振动峰,1 650 cm-1是羰基C O 的特征吸收峰；1 370 cm-1是C—H 振动峰；1 160 cm-1为C—O—C 伸缩振动峰；1 020 cm-1为C—O弯曲振动峰。由图4 可知,DMY 与马铃薯淀粉共糊化后没有产生新的吸收峰,表明DMY 与马铃薯淀粉共糊化后没有新的引入或取代基团。与未添加DMY 的马铃薯淀粉（PS+0%DMY）相比,马铃薯淀粉-二氢杨梅素复合物羟基伸缩峰波数从3 324 cm-1向3 285 cm-1发生位移,推断二氢杨梅素通过氢键相互作用与马铃薯淀粉结合[23]。

2.3 核磁共振氢谱仪分析

为了解试验中所用二氢杨梅素的详细结构,对二氢杨梅素进行了核磁共振氢谱分析。图5 为二氢杨梅素的核磁共振氢谱图。

图5 二氢杨梅素的核磁共振氢谱图Fig.51H NMR spectra of dihydromyricetin

如图5 所示,DMY 的结果如下:1H NMR（500 MHz,DMSO-d6）δ 11.89（s,1H）,10.81（s,1H）,8.90（s,2H）,8.20（s,1H）,6.39（s,2H）,5.90（d,J=2.1 Hz,1H）,5.86（d,J=2.0 Hz,1H）,5.75（d,J=6.2 Hz,1H）,4.90（d,J=10.8 Hz,1H）,4.41（dd,J=10.9,5.6 Hz,1H）,该结果与文献中的一致[24]。DMSO-d6 和水分子的信号峰分别在2.5 Hz和3.3 Hz 处[25]。

为验证二氢杨梅素与马铃薯淀粉是否发生氢键相互作用,故采用核磁共振氢谱仪对复合物进行进一步结构分析。图6 为马铃薯淀粉和马铃薯淀粉-二氢杨梅素复合物核磁共振氢谱图。

图6 马铃薯淀粉和马铃薯淀粉-二氢杨梅素复合物核磁共振氢谱图Fig.61H NMR spectra of potato starch and potato starch-dihydromyricetin complex

由图6 可知,在ppm 4.4～5.6 范围内出现明显的信号峰为淀粉分子所含的—OH 基团的化学位移。未添加DMY 的马铃薯淀粉的葡萄糖重复单元中C3、C2、C6 处的—OH 在ppm 5.49、5.39、4.57 处出现信号峰。加入DMY 后,葡萄糖重复单元中C3、C6 处所连—OH共振吸收频率发生变化,出现吸收峰向高场移动的现象。其中C3、C2、C6 处的—OH 化学位移分别移动范围为0.01、0.01、0.01。徐敏[15]研究发现茶多酚与淀粉发生氢键相互作用,1H NMR 图表示淀粉的葡萄糖重复单元中C2、C3、C6 处化学位移向高场移动。复合物在ppm 11.89、10.81、8.90、6.39、5.90、5.86 处出现的信号峰,可能是未与淀粉发生相互作用而游离的DMY。

2.4 扫描电镜分析

为探究二氢杨梅素与马铃薯淀粉之间相互作用对马铃薯淀粉微观结构的影响,故采用扫描电镜对其直观分析。

图7 为二氢杨梅素、天然马铃薯淀粉及马铃薯-二氢杨梅素复合物颗粒的扫描电镜图。

图7 二氢杨梅素、天然马铃薯淀粉及马铃薯-二氢杨梅素复合物颗粒的扫描电镜图Fig.7 Scanning electron microscopy of dihydromyricetin，potato starch and potato-dihydromyricetin complex particles

由图7 所示,天然的DMY 以针状晶体的形式存在,天然的马铃薯淀粉呈现椭圆形结构,结构完整,颗粒直径较大[26]。未添加DMY 的马铃薯淀粉由原来的椭圆状结构变为不规则的片状结构,表面粗糙。DMY使马铃薯淀粉颗粒表面呈现无序紊乱结构,出现明显的孔隙。DMY 与淀粉相互作用致使淀粉颗粒发生改变,出现了无序疏松的孔状结构。这与韩雪琴[14]在研究阿魏酸对淀粉微观结构的结果一致。多酚与淀粉发生了相互作用,阻碍了淀粉间的重排,影响淀粉的有序性,淀粉颗粒表面结构越疏松。

2.5 二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物的抗氧化性研究

二氢杨梅素作为一种天然的多酚类物质,具有一定的抗氧化生物活性[4]。为探讨二氢杨梅素-马铃薯淀粉发生氢键相互作用后的抗氧化性,因此设计该复合物对DPPH、ABTS+、羟基自由基的清除试验。

2.5.1 DPPH 自由基清除率的测定

图8 为二氢杨梅素和二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物对DPPH 自由基的清除率对比图。

图8 二氢杨梅素和二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物对DPPH 自由基的清除率对比Fig.8 Comparison of scavenging rates of DPPH free radical by dihydromyricetin and complex

由图8 可知,二氢杨梅素添加量为5% 的复合物所对应的二氢杨梅素单体的质量对DPPH 的清除率高达95.78%,这与Wu 等[27]的研究结果相似。继续增加二氢杨梅素单体的质量,DPPH 自由基清除率无明显变化。有研究表明二氢杨梅素分子结构的B 环中的3′、4′、5′相邻羟基提供抗氧化作用[26]。在相同反应条件下,与二氢杨梅素添加量为0%的马铃薯淀粉相比,二氢杨梅素添加量为5%的复合物的DPPH 自由基清除率明显增强,当继续增加二氢杨梅素的添加量,复合物对DPPH 自由基清除率没有明显增加,表明二氢杨梅素添加量与复合物的抗氧化性不成浓度依赖关系。此外,二氢杨梅素单体对DPPH 自由基清除的效果与复合物对DPPH 自由基清除效果无明显差异。综上所述,淀粉复合物对DPPH 自由基清除能力主要归因于二氢杨梅素本身具有较高的DPPH 自由基清除能力。

2.5.2 ABTS+·清除率的测定

图9 为二氢杨梅素和复合物对ABTS+·的清除率对比图。

图9 二氢杨梅素和二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物对ABTS+·的清除率对比Fig.9 Comparison of scavenging rates of ABTS+·by dihydromyricetin and complex

由图9 可知,未添加二氢杨梅素的马铃薯淀粉清除率接近于零,可忽略不计。当加入5%的二氢杨梅素淀粉后,马铃薯淀粉复合物ABTS+·清除率高达91.55%,这可能是二氢杨梅素的加入影响马铃薯淀粉对ABTS+·的清除能力。Geng 等[28]研究发现二氢杨梅素对ABTS+·清除率在90%以上。其次,二氢杨梅素的添加量和复合物对ABTS+·的清除率没有呈现剂量依赖性。综上所述,淀粉复合物对ABTS+·具有较好的清除效果,这可能是当二氢杨梅素与马铃薯淀粉相互作用后,二氢杨梅素对ABTS+·清除能力没有明显被削弱。

2.5.3 ·OH 清除率的测定

图10 为二氢杨梅素和复合物对·OH 的清除率对比。

图10 二氢杨梅素和二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物对·OH 的清除率对比Fig.10 Comparison of scavenging rates of·OH scavenging rate by dihydromyricetin and complex

由图10 可知,未添加DMY 的马铃薯淀粉对·OH清除率接近于0；未添加DMY 的马铃薯淀粉的羟基清除率为27.69%。有研究表明磷含量与·OH 的清除率成正相关。马铃薯淀粉的磷含量高于其他谷物淀粉[29]。因此马铃薯淀粉本身具备一定的清除·OH 能力。二氢杨梅素单体与·OH 清除率呈现一定的剂量效应关系。张姝萍[30]研究表明DMY 的样品浓度在25～800µg/mL 的浓度范围内,对·OH 的清除能力呈上升趋势。DMY 可提高复合物的·OH 清除率并且随着DMY 添加量的增加,复合物的·OH 清除率逐渐提高。综上所述,二氢杨梅素的加入增强了马铃薯淀粉对·OH 的清除能力。

3 结论

通过共糊化法制备二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物。XRD、FI-IR、NMR、SEM 结果表明二氢杨梅素与马铃薯淀粉在共糊化过程中二者发生氢键相互作用,淀粉颗粒结构发生改变。通过分析DPPH·、ABTS+·、·OH 抗氧化性指标发现,DMY 的加入提高了马铃薯淀粉的抗氧化性。与二氢杨梅素单体相比,二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物对DPPH·、ABTS+·的清除能力无明显差异。DMY 添加量与二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物的·OH 清除率呈现浓度依赖关系。本研究为DMY在淀粉基食品的应用提供理论基础。后续可开展二氢杨梅素-马铃薯淀粉复合物抗炎抑菌、降血糖等功能特性的研究。