德氏乳杆菌KY20 胞外多糖对C57BL/6 小鼠肥胖的预防作用

张天宇，申敬，曹瑾，赵崇杰，江雨男，秦琳琳，孙偲，郝力壮，陈勉，王楠*

（1.天津科技大学生物工程学院,教育部工业发酵微生物学重点实验室,天津 300457；2.青海百分牛生物科技有限公司,青海西宁 810016；3.青海大学青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室,青海西宁 810016；4.山东省药学科学院,山东济南 250101）

近年来,我国肥胖和Ⅱ型糖尿病的发病率快速上升。据2020 年国家卫健委公布的数据,18 岁以上成年人肥胖率达到16.4%[1-2],2019 年,在中国非传染性疾病相关的死亡病例中,由超重和肥胖导致的占11.1%[3]。目前,缓解肥胖的手段主要包括饮食调节、运动、手术治疗和药物调节。但手术治疗和药物调节存在安全性、副作用等问题,所以仅适用于少数患者[4-5],相对而言人们更愿意接受健康合理的饮食调节方式。近年来,益生菌及其后生元对健康的调节作用日益受到人们的关注,益生菌的干预可以有效改善肥胖,并具有公认的安全性。

已有大量研究证实益生菌可以缓解肥胖[6]、降低胰岛素抵抗[7]、减轻炎症[8],对肥胖及其并发症具有较好的改善作用[9-10],其主要机制包括抑制胆固醇合成酶活性、抑制食欲进而减少摄入高热量食物、调节肠道菌群、改善肠道屏障、降低炎症因子水平、提高胰岛素敏感性等。目前已有多种乳酸菌菌株表现出较为明显的抗肥胖作用。Zarrati 等[11]以76 名健康超重和肥胖个体为研究对象,发现益生菌（嗜酸乳杆菌La5、双歧杆菌BB12 和干酪乳杆菌DN001）酸奶及减肥饮食干预会明显降低体质量指数和脂肪百分比。补充合生元（含有嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和双歧杆菌加菊粉）也可以为超重或肥胖的受试者带来许多健康益处,包括改善甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、体重、压力、焦虑和抑郁[12]。干酪乳杆菌IMV B-7280[13]、发酵乳杆菌KUB-D18[14]等均已被证实具有降胆固醇、抑制肥胖的效果。Hallajzadeh 等[15]证实德氏乳杆菌PTCC1057 能够显著降低糖尿病小鼠血糖水平。

乳酸菌的胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）是乳酸菌生长代谢过程中分泌的一类糖类化合物,具有抗氧化、抗肿瘤、调节机体免疫、改善肠道菌群等多种功效[16-17]。除了上述研究较多的功效,也有少量研究证实乳酸菌的胞外多糖可以改善肥胖。Zhang 等[18]研究表明,从鼠李糖乳杆菌GG 中分离的EPS 能够有效降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏三酰甘油和胆固醇水平,抑制脂肪形成。相对而言,德氏乳杆菌胞外多糖在抗肥胖方面的研究较少,因此,对其EPS 降脂减肥功效的研究具有重要意义。本课题组前期从河套地区传统发酵乳制品中分离得到一株德氏乳杆菌KY20,发现其具有较好的抗氧化活性,但菌株及其EPS 是否具有降脂减肥的作用尚未可知。因此本研究通过分离提取KY20 的胞外多糖,探究KY20 及其胞外多糖对肥胖的抑制作用,旨在为预防治疗肥胖及其相关疾病提供新的研究思路和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与动物

自河套地区分离的传统发酵乳制品的德氏乳杆菌保加利亚亚种KY20:保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,CGMCC 编号20084；无特定病原体（specific pathogen free,SPF）动物C57BL/6J 雄性小鼠[6～8 周龄,许可证号SCXK（京）2021-0006]:北京维通利华实验动物技术有限技术公司；动物高脂饲料（D12492）:美国Research Diets 公司。

1.1.2 主要试剂

MRS 液体培养基:北京索莱宝科技有限公司；三氯乙酸、无水乙醇（均为分析纯）:天津市江天化工技术有限公司；总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。

1.1.3 仪器与设备

台式离心机（TGL-16C 型）:上海天呈实验仪器制造有限公司；厌氧培养箱（SPX-150 型）:湖南凯达科学仪器有限公司；厌氧培养箱（YQX-Ⅲ）:上海跃进医疗器械有限公司；多功能酶标仪（iD3）:美谷分子仪器（上海）有限公司；血糖仪、血糖试纸（优易GM501）:三诺生物传感股份有限公司；气相色谱仪（GC-7890）:美国Agilent 公司；傅里叶变换红外光谱仪（Bruker Vetex 70 FT-IR）:德国布鲁克公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的生长曲线及耐受性的测定

1.2.1.1 菌株的生长曲线

将活化两次的KY20 接种于MRS 液体培养基中,置于37 ℃厌氧培养箱中培养24 h,每隔1 h 取样1 次,并在波长600 nm 处测定吸光值,绘制菌株的生长曲线。

1.2.1.2 耐酸性、耐胆盐能力测定

耐酸能力测定:将KY20 接种于pH 值为1.0、2.0、3.0、4.0 的MRS 液体培养基中；耐胆盐能力测定:将KY20 接种于不同胆盐浓度（0.1%、0.2%、0.3%）的MRS液体培养基中,置于37 ℃厌氧培养箱中4 h,通过测量490 nm 处的吸光值,按照下列公式计算存活率。

式中:ɑ为存活率,%；b为实验组吸光值；c为对照组的吸光值。

1.2.1.3 耐药性测定

采用K-B 纸片扩散法,将37 ℃倒置培养24 h 后的平板取出测定其抑菌圈直径。

1.2.2 胞外多糖的提取、纯化及结构分析

1.2.2.1 胞外多糖的提取和纯化

KY20 培养过夜后收集菌液煮沸,除去菌体沉淀,将发酵液在8 000 r/min、4 ℃离心20 min,收集上清液,蒸发浓缩；三氯乙酸法除蛋白,水提醇沉法提取多糖,透析后真空冷冻即为胞外多糖粗品。将胞外多糖粗品过DEAE-52 阴离子交换柱,分别收集0～0.5 mol/L NaCl 洗脱溶液,其中以0.1 mol/L NaCl 洗脱的多糖为主,收集并合并单一峰组分,去离子水透析至无Cl-检出并冷冻干燥。

1.2.2.2 胞外多糖的主要成分测定

参考王晓楠[19]的方法,通过苯酚-硫酸法测定多糖含量,间羟基联苯法测定糖醛酸含量,考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；参考仇小妹等[20]的方法,通过Folin 法测定总酚含量。

1.2.2.3 胞外多糖的分子量测定

使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）对多糖的分子量进行测定,色谱柱为TSKgel G4000PWXL（10µm,7.8 mm×300 mm）,进样量为20µL,流速为0.5 mL/min,柱温为38 ℃。采用不同分子量的D-葡聚糖为标准品绘制标准曲线为y=-31 617x+30.684,根据出峰时间计算样品的相对分子质量。

1.2.2.4 紫外光谱测定

用双蒸水配制0.5 mg/mL 多糖溶液,用0.22µm滤膜过滤后进行紫外光谱扫描（波长230～380 nm）,样品流速为0.5 mL/min。

1.2.2.5 傅里叶变换红外光谱测定

将干燥的EPS（2 mg）用溴化钾粉末（200 mg）研磨并压制成片剂,然后使用傅里叶变换红外光谱仪在4 000～400 cm-1范围内扫描。

1.2.3 动物实验

1.2.3.1 小鼠分组与饲养

C57BL/6J 小鼠用普通饲料适应性喂养1 周后随机分为6 组,分别为正常组、模型组、KY20 组、EPS 低剂量组、EPS 中剂量组、EPS 高剂量组。正常组为普通饲料喂养,模型组、KY20 组、EPS 组均给予高脂饲料喂养,KY20 组按照1×108CFU/次给予KY20,EPS 低、中、高组分别按50、100 mg/kg 和200 mg/kg 给予KY20 胞外多糖,各组均隔日灌胃,连续12 周。

1.2.3.2 葡萄糖耐量（glucose tolerant,GTT）的测定

实验结束前,按2 g/kg 葡萄糖剂量对小鼠进行腹腔注射,在不同时间对小鼠进行尾静脉取血,测量小鼠的血糖值并计算曲线下面积（area under curve,AUC）,AUC 的计算公式如下。

式中:A为AUC,h·（mmol/L）；c0min、c15min、c30min、c60min、c120min为不同时间的血糖值,mmol/L。

1.2.3.3 胰岛素耐量（insulin tolerant,ITT）的测定

实验结束前,按照0.75 U/kg 的胰岛素剂量对小鼠进行腹腔注射,在不同时间测量小鼠的血糖值。按照

1.2.3.2 公式计算曲线下面积。

1.2.3.4 胰岛素抵抗指数测定

对小鼠进行尾尖取血并用血糖仪测量空腹血糖,采用试剂盒检测小鼠血清中的胰岛素含量,计算胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）。HOMA-IR 计算公式如下。

式中:z为胰岛素抵抗指数；m为胰岛素含量,mmol/L；n为空腹血糖值,mmol/L；22.5 为校正因子。

1.2.3.5 样品采集

实验结束后,对小鼠进行眼球取血,收集血清于-20 ℃保存；取小鼠的肝脏、肾脏、胰腺、脾脏进行称重,并将肝脏、脂肪固定于多聚甲醛；取皮下、附睾、肩胛脂肪组织并称重,取盲肠内容物于-80 ℃保存。

1.2.3.6 组织病理学分析

取小鼠的组织置于固定液中,使组织、细胞的蛋白质变性凝固,蒸馏水清洗组织表面的固定液后,分别用不同浓度的乙醇浸泡,逐渐脱去组织中的水分；然后用体积比为1∶1 的无水乙醇与二甲苯溶液、二甲苯溶液分别浸泡30 min,以二甲苯替换出组织中的乙醇；将透明的组织用石蜡液体浸渗3 次,每次1 h,用包埋框包埋,固定好后切成3µm 薄片,并在恒温摊片烤片机中37.5 ℃恒温下进行烤片2 h；用二甲苯脱去切片中的石蜡后,不同浓度的乙醇处理除去切片中的二甲苯,蒸馏水浸泡1 min,自然风干,磷酸盐缓冲液清洗3 次后进行染色；苏木素染色3 min；自来水洗片2 min；用1%盐酸酒精溶液分化；用2% 伊红溶液染色3 min；蒸馏水冲洗2 min,重复3 次；无水乙醇脱水,二甲苯透明；中性树胶封片；最后在正置荧光显微镜下进行观察。

1.2.3.7 血脂指标测定

将血清放置冰上解冻后,按照相应试剂盒的操作步骤,采用多功能酶标仪测定血清中总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的含量。

1.2.3.8 短链脂肪酸（short chain fatty acid,SCFAs）含量的测定

取小鼠盲肠内容物,溶于蒸馏水中,涡旋混匀,4 ℃、12 000 r/min 离心取上清液加入100µL 10%硫酸溶液,涡旋混匀后加入1 mL 乙酸乙酯继续涡旋4 ℃离心制备样品。采用的色谱柱及相应进样条件:色谱柱为HP-5（30 m×320µm×0.25µm）,进样量为1µL,进样口温度为250 ℃,分流比为1∶1,柱流速为2 mL/min,柱温:初始柱温为90 ℃,持续6 min,以10 ℃/min 升至200 ℃,并保持6 min。载气的流速为2 mL/min。（氢）火焰离子化检测器检测器温度为250 ℃,氢气和空气的流量分别为30 mL/min 和300 mL/min。

1.3 数据处理

实验结果以平均值±标准差表示,实验数据利用软件Graphpad prism 6 进行统计学分析,多组间比较采用one-way ANOVA 分析,P<0.05 时,表示与比较组有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 菌株KY20 的生长与益生特性

2.1.1 菌株KY20 的生长曲线

德氏乳杆菌KY20 的生长曲线见图1。

图1 德氏乳杆菌KY20 的生长曲线Fig.1 Growth curve of Lactobacillus delbrueckii KY20

由图1 可知,德氏乳杆菌KY20 在4 h 后进入对数生长期,9 h 进入平衡期,达到最大生长速率。

2.1.2 菌株KY20 耐受性结果分析

菌株KY20 的耐受性如图2 所示。

图2 德氏乳杆菌KY20 的耐受性Fig.2 Tolerance of Lactobacillus delbrueckii KY20

由图2A 可知,菌株KY20 在pH1、pH2、pH3 条件下培养4 h 后存活率分别为（44.26±1.21）%、（49.18±1.42）%和（50.01±0.64）%,而pH4 条件下存活率可达（81.54±1.75）%。由图2B 可知,将菌株KY20 在胆盐浓度为0.10%、0.20% 和0.30% 的MRS 液体培养基中培养4 h 后,存活率分别为（84.08±4.67）%、（59.10±0.95）%和（52.86±1.19）%。因此,德氏乳杆菌KY20 展示出较强的耐酸、胆盐耐受能力。

2.1.3 菌株KY20 药敏试验结果

德氏乳杆菌KY20 的药物敏感性见表1。

表1 德氏乳杆菌KY20 的药物敏感性Table 1 Antibiotic susceptibility of Lactobacillus delbrueckii KY20

由表1 可知,德氏乳杆菌KY20 对青霉素、庆大霉素、环丙沙星、利福平敏感；对链霉素和红霉素中度敏感；而对亚胺培南、卡那霉素、四环素、氯霉素、头孢噻吩、头孢他啶、头孢噻肟、万古霉素均不敏感。

2.2 菌株KY20 胞外多糖提取分离与性质鉴定

2.2.1 菌株KY20 胞外多糖提取分离

EPS 洗脱曲线及HPLC 分析见图3。

图3 EPS 洗脱曲线及HPLC 分析Fig.3 Elution curve and HPLC analysis of exopolysaccharide

由图3 可知,经DEAE-52 阴离子交换树脂进行不同浓度NaCl 溶液洗脱后,德氏乳杆菌KY20 洗脱峰以0.1mol/L NaCl 洗脱液为主,说明粗多糖中以酸性多糖为主。将0.1mol/L NaCl 溶液洗脱的多糖进行HPLC分析,在11.766 min 处出现了单一对称的尖峰,表明其为分子质量均一的较纯组分,根据标准曲线,计算得到其分子量约为0.96×103kDa。进一步测定其多糖纯度为（76.43±0.77）%,蛋白质含量为（1.41±0.10）%,糖醛酸含量为（2.29±0.08）%,总酚含量为（0.55±0.24）%。

2.2.2 EPS 的紫外和红外光谱分析

德氏乳杆菌KY20 的紫外光谱和红外光谱见图4。

图4 德氏乳杆菌KY20 的紫外光谱和红外光谱Fig.4 Ultraviolet spectrum and infrared spectra of Lactobacillus delbrueckii KY20

如图4A 所示,纯化后的多糖在230～380 nm 波长范围内,没有出现核酸（260 nm）和蛋白质（280 nm）的明显特征吸收峰,说明不存在或存在非常少量的核酸和蛋白质。如图4B 所示,在3 380 cm-1附近具有强且宽的吸收峰,这个吸收峰是糖类O—H 官能团的伸缩振动引起的,代表该多糖存在分子间和分子内氢键。在2 927 cm-1处的吸收峰是由C—H 官能团的伸缩振动引起的,在这个区域的吸收峰是糖类物质的另一个特征吸收峰。而在1 070 cm-1和1 654 cm-1附近的峰被指定为CO 基团；1 240.57 cm-1处—COOH 中O—H变角振动吸收峰,代表多糖分子间存在羧基或乙酰基基团。

2.3 动物实验结果

2.3.1 菌株KY20 及其EPS 对高脂饮食小鼠体质量的影响

德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对肥胖小鼠体质量的影响见表2。

表2 德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对肥胖小鼠体质量的影响Table 2 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the weight of obese mice

由表2 可知,各组小鼠初始体质量无明显差异,第7 周之前,除正常组外,其余各组与模型组体质量相差不大,7 周后与正常组相比,模型组体质量增长较快,给予KY20 和其EPS 组体质量增长较为缓慢。第12 周实验结束时,与正常组相比,模型组小鼠体质量显著升高,而KY20 及不同剂量的EPS 对小鼠体质量的增加均有抑制作用,其中KY20 及EPS 低剂量组抑制作用最显著。

2.3.2 菌株KY20 及其EPS 对高脂饮食小鼠脂肪质量的影响

德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对肥胖小鼠脂肪质量的影响见表3。

表3 德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对肥胖小鼠脂肪质量的影响（n=6）Table 3 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the fat weight of obese mice（n=6）

由表3 可知,模型组总脂肪质量、附睾脂肪质量和皮下脂肪质量与正常组相比,均具有显著差异,而肩胛脂肪质量无显著差异。与模型组相比,KY20 能够显著减轻附睾脂肪和总脂肪质量,但对肩胛脂肪和皮下脂肪质量没有显著影响。与模型组相比,EPS 低、中剂量组可以显著减轻附睾脂肪质量,EPS 高剂量组对不同组织的脂肪均有一定的减轻作用,但没有显著性差异。

2.3.3 菌株KY20 及其EPS 对高脂饮食小鼠脏器指数的影响

德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对肥胖小鼠脏器指数的影响见表4。

表4 德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对肥胖小鼠脏器指数的影响（n=6）Table 4 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the organ index of obese mice（n=6）

由表4 可知,高脂饮食对小鼠肝脏、脾脏均具有显著性影响,而对肾脏和胰腺的影响无显著性差异。其中对肝脏影响最为显著,KY20 及不同剂量的EPS 对肥胖小鼠肝脏指数增大具有显著的抑制作用,同时对肥胖小鼠脾脏指数的增大也具有不同程度的抑制作用,其中KY20 及EPS 低剂量和中剂量组的抑制作用较为显著。

2.3.4 菌株KY20 及其EPS 对高脂饮食小鼠GTT、ITT以及HOMA-IR 的影响

长期的高脂饮食会引起胰岛素介导的相关作用减弱,比如脂解抑制作用,促使肝脏生成内源性葡萄糖,而胰岛素不能抑制肝糖原的合成,从而导致肝脏发生胰岛素抵抗,引起了血糖水平的升高[21]。KY20 及其EPS 对高脂饮食小鼠GTT、ITT 以及HOMA-IR 的影响结果如图5、图6、图7 所示。

图5 德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对高脂饮食小鼠糖耐量的影响Fig.5 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on glucose tolerance in mice fed with high-fat diet

图6 德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对高脂饮食小鼠胰岛素耐量的影响Fig.6 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on insulin tolerance in mice fed with high-fat diet

图7 德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对高脂饮食小鼠胰岛素抵抗的影响Fig.7 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on insulin resistance in mice fed with high-fat diet

由图5A 可知,注射葡萄糖后各组小鼠的血糖水平均表现为迅速上升,随后便呈现下降的趋势,正常组血糖值在2 h 后恢复到正常水平,而模型组血糖水平下降与其他组相比较为缓慢,2 h 后仍处于较高的水平。由图5B 可知,模型组、德氏乳杆菌KY20 组及其不同剂量EPS 组的葡萄糖耐量均显著高于正常组；与模型组相比,德氏乳杆菌KY20 及其不同剂量的EPS均能够改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠葡萄糖耐量,其中,胞外多糖中剂量组效果显著。

由图6A 可知,除KY20 组外,其他组小鼠血糖值水平在注射胰岛素30 min 时降至最低,随后便呈现回升趋势,模型组小鼠血糖水平与其他组小鼠相比下降较为迟缓,表现出胰岛素抵抗。由图6B 可知,与模型组相比,KY20 组及EPS 低剂量组均显著降低。

由图7 可知,正常组小鼠的胰岛素抵抗指数处于较低水平,模型组小鼠胰岛素抵抗指数最高,而KY20组及其胞外多糖组的小鼠胰岛素抵抗指数显著低于模型组。

已有研究证实,嗜酸乳杆菌NS1 显著减轻了高脂饮食诱导的肥胖并改善胰岛素敏感性[22]。Andreasen等[23]以45 名2 型糖尿病患者为研究对象,给予口服补充嗜酸乳杆菌NCFM,结果发现与安慰剂相比,口服NCFM 可以较好地保持胰岛素敏感性。本研究中德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖有效改善了肥胖小鼠的胰岛素耐受性和葡萄糖耐受性,提高了胰岛素敏感性,并改善了胰岛素抵抗。

2.3.5 菌株KY20 及其EPS 对高脂饮食小鼠肝脏、脂肪的病理学和血脂指标的影响

长期高脂饮食会引起体内代谢紊乱,导致血清中TC、TG、LDL-C 水平的升高和HDL-C 水平降低,引起肝内脂肪堆积形成脂肪肝。KY20 及其EPS 对高脂饮食小鼠肝脏、脂肪的病理学和血脂指标的影响如图8、图9 和表5 所示。

表5 德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对高脂饮食小鼠TG、TC、LDL-C 和HDL-C 含量的影响（n=6）Table 5 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on triglyceride（TG），total cholesterol（TC），lowdensity lipoprotein-cholesterol（LDL-C），high-density lipoproteincholesterol（HDL-C）of mice fed with high-fat diet（n=6）mmol/L

图8 德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对高脂饮食小鼠肝脏的病理学影响Fig.8 Pathological effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the liver of mice fed with high-fat diet

图9 德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对高脂饮食小鼠脂肪的病理学影响Fig.9 Pathological effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the fat of mice fed with high-fat diet

由图8 可知,正常组肝脏组织表现为肝细胞排列规则,结构整齐,边界清晰。而模型组小鼠有较明显的细胞边界不清,肝脏结构紊乱现象,KY20 及其EPS 能够显著减轻这些病变,使肝脏组织的形态趋于正常。

由图9 可知,正常组小鼠的脂肪细胞排列较为规则,呈圆形；而肥胖小鼠脂肪细胞与其他组小鼠的脂肪细胞相比明显偏大,有较明显的脂肪堆积和脂肪变性,KY20 及其EPS 能够明显减小脂肪细胞体积,使脂肪细胞形态和排列趋于正常。

由表5 可知,与正常组相比,模型组的TC、TG、LDL-C 含量显著升高,而HDL-C 含量显著降低。与模型组相比,KY20 及其不同剂量的胞外多糖均可以不同程度降低TC、TG、LDL-C 的含量,其中KY20 组能够较为显著降低TC、TG 的含量并升高HDL-C 含量,而中剂量组能显著降低LDL-C 的含量。

研究表明,益生菌可以有效降低血清、血浆中的胆固醇水平,改善整体脂质谱。Liu 等[24]研究表明,副干酪乳杆菌24 可以通过调节肠道菌群组成降低高脂饮食小鼠的体质量和脂肪沉积,降低血清胆固醇、肝脏脂肪和甘油三酯含量,改善肝脏脂肪变性。此外,微生物EPSs 由于其减脂降糖、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节和抗病毒活性[25],在食品、医学等领域具有较高的应用价值。从副干酪乳杆菌M7 分离出的EPS 在体外浓度为0.1%时,将胆固醇水平降低了70.78%[26],从植物乳杆菌RFJ4 中分离得到的EPS 将胆固醇降低了42.24%[27]。植物乳杆菌L-14 的EPS 可以通过TLR2 和AMPK 信号通路抑制脂肪生成,口服L-14 提取物改善高脂饮食诱导的小鼠肥胖[28]。本研究证实德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖均可以有效降低血清中TC、TG、LDL-C 水平,并且升高了HDL-C,也缓解了高脂饮食诱导的肝脏中脂肪堆积和脂肪细胞的肥大。

2.3.6 菌株KY20 及其EPS 对高脂饮食小鼠SCFAs的影响

肠道微生物发酵膳食纤维、多糖产生SCFAs,SCFAs是肠道上皮细胞的主要能量来源,在维持肠道屏障、调节先天免疫、抑制炎症反应和维持肠道微环境稳态方面发挥重要的作用。KY20 及其EPS 对高脂饮食小鼠SCFAs 的影响如图10 所示。

图10 德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖对高脂饮食小鼠血脂SCFAs 的影响Fig.10 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the short chain fatty acids（SCFAs）of mice fed with high-fat diet

由图10 可知,与正常组相比,模型组的乙酸、丙酸、丁酸的含量显著降低。与模型组相比,德氏乳杆菌KY20 组及不同剂量的胞外多糖对不同短链脂肪酸具有一定的恢复作用,其中对丁酸的上调作用最为显著。Zhao 等[29]发现SCFAs 中的乙酸和丁酸可以通过上调肽酪氨酸（peptide tyrosine tyrosine,PYY）和胰高血素样肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）的水平,抑制中枢神经,减少食欲,从而达到减轻体质量的效果。本研究通过对肥胖小鼠盲肠内容物的检测发现,德氏乳杆菌KY20 及其胞外多糖均显著逆转了由高脂饮食诱导肥胖小鼠丁酸水平下降的情况,从而减轻了肥胖小鼠的体质量。

3 结论

本研究中从德氏乳杆菌KY20 提取的EPS 是分子量为0.96×103kDa 的酸性多糖,EPS 低、中、高剂量对肥胖小鼠各项指标均具有一定的改善效果,其中低剂量组和中剂量组在体部分指标中具有显著优势。

KY20 菌株具有良好的酸耐受性和胆盐耐受能力,且菌株KY20 及其胞外多糖均可以有效抑制高脂饮食诱导的肥胖,降低肥胖小鼠的体质量,改善血脂代谢紊乱、改善肝脏脂肪变性程度和脂肪细胞肥大、调节葡萄糖耐受和胰岛素耐受,因此,本研究对于德氏乳杆菌KY20 及其后生元（胞外多糖）在食品、医药领域的应用开发具有积极意义。