组分差异分析结合智能感官对本草栽培银耳风味特征的分析

陈万超

吴 迪1,2,3

肖敏生4

姚淑先5

杨 焱1,2,3

刘艳芳1,2,3

(1. 上海市农业科学院食用菌研究所,上海 201403;2. 农业农村部南方食用菌资源利用重点实验室,上海 201403;3. 国家食用菌工程技术研究中心,上海 201403;4. 上海开森生物科技有限公司,上海 201824;5. 福建山湖本草银耳有限公司,福建 宁德 352262)

银耳,又称白木耳、雪耳等,属于担子菌门、银耳纲、银耳目、银耳科、银耳属,是一种常见的食药两用真菌。

中国银耳栽培分布主要是福建、四川等地,其中福建古田银耳历史悠久,产量占全球90%以上[1]。福建古田代料栽培银耳普遍为黄色银耳(Tr01)和白色银耳(Tr21)[1],栽培基质主要采用棉籽壳、麦麸等。除此之外,亦存在以传统植物本草为基质的栽培技术,目前研究主要集中在栽培设施设备的开发,关于本草基质对银耳子实体的品质影响的研究鲜有报道。本草基质栽培银耳所选用的栽培品种为白色银耳,旨在弥补银耳的营养缺陷,如粗多糖含量较低,对人体的滋补效果不明显等[2]。对于饮食习惯,大众消费的主要以黄色银耳为主,其肉质脆爽,常作为拌菜的食材,而对于白色银耳的食用习惯并未建立,其内在原因值得进一步挖掘。研究拟以常规栽培基质的黄色银耳和白色银耳为参考,传统植物本草为基质的白色银耳为研究对象,通过高效液相色谱技术和顶空固相微萃取—气相色谱—质谱联用技术(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对3种银耳中主要的滋味成分(游离氨基酸和核苷酸)进行测定,基于这些组分的差异分析结合智能感官(如电子舌和电子鼻)探究3种银耳的风味特征,以期为银耳作为食材用于烹饪提供理论支撑,同时为本草栽培银耳的高值利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄色银耳、白色银耳和本草基质栽培白色银耳(本草银耳):其鲜品银耳子实体均于2022年11月产自福建古田,上海开森生物科技有限公司;

粉碎机:QE-400型,浙江屹立工贸有限公司;

水分测定仪:MA100型,德国Sartorius公司;

离心机:Allegra 25R Centrifuge型,美国Beckman公司;

超纯水设备:ELGA型,美国ULTRA公司;

液相色谱:Waters E2695 Alliance型,美国Waters公司;

高效液相色谱仪:Waters 600型,美国Waters公司;

二极管阵列检测器:2996型,美国Waters公司;

味觉分析系统:SA-402B型,日本INSENT公司;

气质联用仪:7890A-5975C型,安捷伦科技(上海)有限公司;

电子鼻:PEN2型,德国Airsense公司。

1.2 试验方法

1.2.1 游离氨基酸测定 参考Boogers等[3]的方法,准确称取银耳样品500 mg于50 mL离心管,加入20 mL超纯水,沸水浴加热提取10 min(每5 min混匀一次),趁热抽滤,冷至室温后定容至50 mL,过0.22 μm混合纤维素微孔滤膜,备用。样品衍生化:分别准确吸取20 μL样品溶液于衍生管(6 mm×50 mm),加入140 μL硼酸盐缓冲液,涡旋混匀后加入40 μL衍生剂。室温放置1 min,55 ℃下加热10 min,取出待测。液相测定条件与陈荣荣等[4]的方法相同。

1.2.2 游离5′-核苷酸测定 参考陈万超等[5]的检测方法,准确称取银耳样品1 000 mg,加入25 mL蒸馏水,煮沸并保持1 min,冷却至室温,16 000×g离心15 min,取出上清液,过0.22 μm微孔滤膜,待测。色谱条件:Ultimate AQ -C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:KH2PO4缓冲盐(pH 4.68);流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;进样量10 μL;紫外检测波长249 nm。

1.2.3 挥发性香气成分HS-SPME-GC-MS测定 参考李文等[6]的分析和数据处理方法,略有修改,采用顶空固相微萃取—气相色谱—质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)进行测定,准确称取0.5 g,置于20 mL顶空瓶中,加入5 mL水和10 μL二氯苯(内标物,100 μg/mL)迅速混匀待测。顶空瓶置于55 ℃条件平衡30 min,将75 μm DVB/CAR/PDMS萃取头经30 ℃老化20 min 后插入顶空瓶中,平衡吸附30 min,后立即将纤维萃取头抽出并转移到GC-MS进样口中,推出萃取头中的纤维头,在250 ℃下解吸10 min。

1.2.4 电子舌分析 采用SA-402B味觉分析系统对离心后的酶解液进行测定。该装置具有8个传感器,分别为CA0(酸味)、C00(苦味)、CT0(咸味)、AAE(鲜味)、AE1(涩味)、甜味(GL1)和2个参比传感器。在样品测试前,提前将传感器活化并进行自检,待各传感器数值稳定在允许范围内,即CA0和AAE为-80～80 V,CT0 90～130 V,C00和AE1 80～160 V,方可进行测定。参数设置:测定5次,正负极清洗90 s,标准清洗液2和3均清洗120 s,参比液(30 mmol/L 氯化钾+0.3 mmol/L 酒石酸)测定30 s,静止1 s,样品测定30 s,标准清洗液4和5分别清洗3 s,参比液(30 mmol/L 氯化钾+0.3 mmol/L 酒石酸)测定30 s。

1.2.5 电子鼻分析 采用直接顶空吸气法,称取1.0 g样品置于20 mL顶空瓶内,用带有PTFE密封垫的盖子密封,静止10 min待测。以洁净干燥空气为载气,设置电子鼻采样时间为160 s,气体流量为0.3 L/min,等待时间为10 s,清洗时间60 s。每个样品重复6次,取稳定后的3次数据,进行下一步数据分析。

表1 电子鼻传感器阵列名称及其性能描述

1.2.6 等鲜浓度值计算 等鲜浓度值(equivalent umami concentration,EUC)是指100 g干样品中,呈鲜物质的总量,常用谷氨酸钠(monosodium glutamate,MSG)的含量表示[7]。其计算公式为:

Y=∑aibi+1 218(∑aibi)(∑ajbj),

(1)

式中:

Y——味精当量即EUC值,g MSG/100 g;

ai——呈鲜氨基酸的含量,如天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu),g/100 g;

aj——呈鲜核苷酸的含量,如鸟苷酸(5′-GMP)、肌苷酸(5′-IMP)、黄苷酸(5′-XMP)和腺苷酸(5′-AMP),g/100 g;

bi——呈鲜氨基酸相对MSG的鲜味程度(Glu为1,Asp为0.077);

bj——呈味核苷酸相对5′-IMP的值(5′-IMP为1,5′-GMP为2.3,5′-XMP为0.61,5′-AMP为0.18);

1 218——协同作用常数。

1.3 数据处理

利用Matlab 2020b,生科云(https://www.bioincloud.tech/)信息分析云平台和TBtools等工具进行可视化绘图。利用Excel 2019和IBM SPSS Statistic 25进行数据分析和处理,数据均以平均数±标准偏差表示,采用Tukey HSD检验进行显著性分析(显著水平P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 银耳样品滋味组分分析

食用菌以鲜香美味著称,其中鲜味的重要载体包括Asp、Glu等游离氨基酸,以及5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP和5′-AMP等游离5′-核苷酸。如表2所示,从氨基酸组成看,3种银耳样品氨基酸种类存在一定差异,其中半胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)均未检出,甲硫氨酸(Met)仅在黄色银耳中有检出,赖氨酸(Lys)和异亮氨酸(Ile)则分别在白色银耳和黄色银耳中未检出。在含量层面,白银耳的游离氨基酸总量相对最高(8.33 mg/g),其次为普通银耳(7.69 mg/g),本草银耳的最低(7.37 mg/g);3种银耳中均以精氨酸(Arg,1.51～2.52 mg/g)和Glu(1.03～2.12 mg/g)含量较高,前者具有良好的清除自由基延缓衰老的功效[8],后者可以提高鲜美的口感。对于呈味氨基酸,鲜味氨基酸和甜味氨基酸主要以Glu和甘氨酸(Gly,0.42～0.43 mg/g)为主,前者以普通银耳的最高,比本草银耳和白色银耳分别高出42.3%和105.8%,由此可见黄色银耳样品鲜味较为浓郁,白色银耳品种本身鲜味较淡;后者在3种样品中差异不显著(P<0.5),即甘甜味差异不大。

表2 本草银耳、白色银耳和黄色银耳中游离氨基酸和5′-核苷酸含量测定结果†

5′-核苷酸是典型的呈鲜物质,近年来“I+G”(即“肌苷酸+鸟苷酸”)被广泛应用在调味品中,以增加食品的鲜味。由表2可知,3种样品中6种游离核苷酸可检出5种,5′-XMP除外。游离5′-核苷酸总量以黄色银耳含量最高(1.09 mg/g),其次为草本银耳(0.67 mg/g),白色银耳的最低(0.36 mg/g)。就单一核苷酸而言,5′-CMP含量相对丰富(0.10～0.45 mg/g);呈味核苷酸则以5′-GMP含量较高(0.06～0.29 mg/g),有研究[9]显示其有很强的助鲜作用,在与呈味氨基酸等的协同作用下可以使鲜度提高几十倍甚至几百倍之高。除5′-IMP外,黄色银耳中5′-核苷酸含量普遍高于其他两种银耳样品,尤其对于呈味核苷酸总量(0.40 mg/g)比本草银耳(0.18 mg/g)和白色银耳(0.18 mg/g)高出122.2%,该结果亦可以看出黄色银耳样品较其他两种样品的鲜味更为浓郁。

2.2 银耳样品的滋味物质的呈味作用和鲜味强度评价

滋味活度值(taste active value,TAV)可以用于表征单一化合物对整体滋味的贡献,TAV<1表示该物质对样品滋味没有贡献,TAV>1则表示有贡献,且贡献度与数值正相关。如表3所示,仅Glu、Arg和His,以及白色银耳品种样品才有的Ile的TAV高于1,且分别为3.43～7.07,3.02～5.04,3.00～3.90和1.44～2.86,说明Glu对于鲜味有较大的贡献,而Arg虽然对苦味有贡献,但是其可以与Glu和食盐协同作用产生令人愉快的风味[10],另外His和Ile也对苦味有贡献。虽然丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)和Gly的TAV<1,但它们与IMP协同作用可以增强鲜味[11]。从鲜、甜味TAV总和可以看出,黄色银耳鲜味更为突出。

表3 银耳样品滋味物质的阈值和滋味活度值†

5′-核苷酸与鲜味氨基酸的协同作用是提高食用菌鲜味的主要因素,可以通过EUC从另一个角度来评价样品的鲜味强度。有研究[12]将EUC评价鲜味程度分为4个水平:>1 000,100～1 000,10～100,<10 g MSG/100 g。本草银耳、白银耳和普通银耳的EUC值对比见图1,可以直观看出普通银耳鲜味强度高于其他两种样品(P<0.01),且处于第3个水平,另两个样品则处于最低水平。综上所述,研究通过鲜味物质含量、TAV以及EUC等多个维度分析发现,黄色银耳鲜味突出,更适合作为烹饪的佐料,这也符合了人们日常的饮食习惯;而白银耳鲜味强度较低,特别是本草银耳,在调制饮品时,口感更易于消费者接受。

**为存在极显著差异(P<0.01)

2.3 银耳样品电子舌分析

如图2(a)所示,不同银耳样品差异不明显,仅在酸味有轮廓的波动。采用主成分分析(principle component analysis,PCA)对不同银耳样品的滋味进行进一步挖掘分析,结果如图2(b)所示,主成分1(principle component 1,PC1)贡献率占比47.4%,主成分2(principle component 2,PC2)贡献率占比25.3%,前两个主成分累积贡献率占比72.7%,可以看出不同样品间存在明显差异。虽然雷达图谱整体差异不大,但是通过PCA可挖掘到细微差异,以及不同味道对样品整体呈味贡献程度是存在差异的。黄色银耳鲜、甜味突出,更适合作为菜肴的佐料,这与成分分析和EUC评价结果相吻合;本草银耳具有一定苦味和苦味回味,可能与本身苦味氨基酸以及本草基质存在的一些苦味物质迁移到子实体中有关。

图2 本草银耳、白色银耳和黄色银耳电子舌滋味分析及其PCA结果

2.4 银耳样品SPME-GC-MS挥发性成分分析

4种银耳样品经SPME萃取后,结合GC-MS分析,挥发性成分GC-MS总离子流图见图3。如图4(a)所示,黄色银耳、白色银耳和本草银耳分别鉴定得到49,71,82种化合物,可见白银耳香气物质丰富度要高于普通银耳,且经过本草基质改良后,香气丰富度进一步提升;其中主要以酯类和醛类为主,本草银耳中酯类检出17种,占比约21%,其次是烷烃类化合物(12种,占比15.32%),通常情况下,大多烷烃类化合物香气较弱或无味,但烃类化合物可能作为杂环类化合物的重要中间体对风味形成具有基底作用,且在一些情况下,它们可以作为辅助呈香物质,使得香气更为柔和。如图4(b)所示,本草银耳烷烃类化合物相对含量占比较高(14.23%),相对于白色银耳(醛类占比较高,13.82%)香气更加柔和,而黄色银耳则香气较为平淡,没有较为突出的香气种类。

图3 3种银耳样品GC-MS总离子流图

图4 3种银耳样品香气化合物种类及其相对含量

如表4所示,筛选得到了26种银耳特征香气成分(即表3前26个化合物),它们不随品种和基质改变而消失,包括6种酯类、5种醛类、4种芳香类化合物、2种醇类、2种杂环化合物、2种烷烃化合物、2种八碳化合物、1种酮类、1种酸类和1种酚类化合物。白色银耳特有化合物有27～35号化合物,包括6种酮类、2种醇类和1种醛类化合物,它们主要以花香、甜香为主。本草银耳特有化合物有36～39号化合物,包括酯类、酸类、醇类和杂环类化合物各1种,分别呈现花香、草本和烟草香等。

表4 银耳特征指纹香气成分†

2.5 银耳样品电子鼻分析

研究所使用的电子鼻包含10个传感器,其名称和性能描述如表4所示,对银耳样品各传感器响应值绘图见图5(a),其中W1W、W5S、W1S和W2W等传感器响应存在差异。基于PCA整体差异分析,PC1和PC2的贡献率占比分别为77.7%和10.1%,累积贡献率达87.8%,大于85%[14],可见两个主成分包含了3种银耳样品的大部分特征信息(87.8%),可以描述不同银耳样品之间香气物质特征的差异;如图5(b)所示,白色银耳系列相对聚集,与普通银耳区分明显,且主要差异体现在PC1上。品种造成的香气差异程度要大于不同基质所产生的影响,从另一个角度可以表明,电子舌加PCA具有用于不同品种样品的初步鉴别的潜力。

图5 智能感官电子鼻传感器响应值雷达图谱和PCA得分图

3 结论

采用高效液相色谱法和HS-SPME-GC-MS技术对不同栽培基质的银耳样品中的主要滋味成分和挥发性成分进行分析,并结合智能感官电子舌和电子鼻技术对样品的风味特征进行了解析。结果表明,游离鲜味氨基酸以普通银耳含量最高,比白色银耳和本草基质栽培的白色银耳分别高出105.8%和42.3%。黄色银耳呈味核苷酸总量比白色银耳和本草基质栽培的白色银耳高出122.2%,反映出黄色银耳样品鲜味更为浓郁。本草基质栽培的白色银耳和白色银耳鲜味较淡。电子舌滋味值雷达图谱观测到3种样品差异不明显,通过PCA进一步分析,可以看出样品间存在明显差异,其中普通银耳鲜、甜味突出,本草基质栽培的白色银耳具有一定苦味和苦味回味。挥发性成分鉴定结果显示,本草基质栽培的白色银耳鉴定得到82种挥发性物质,高于白色银耳和黄色银耳,以酯类为主,占比16.9%～22.4%,呈现浓郁的花草芳香。香气物质含量方面本草基质栽培的白色银耳亦占据优势,其中烷烃类化合物相对含量占比较高,相对于白色银耳香气更加柔和。不同样品电子鼻传感器响应值雷达图谱亦差异不明显,通过PCA整体差异分析发现,白银耳系列相对聚集,并且可与普通银耳产生区分。品种造成的香气差异程度要大于不同基质所产生的影响。综上所述,本草基质栽培的白色银耳鲜味淡香气浓,可开发调制饮品,而黄色银耳更适合作为菜肴。