辉光放电等离子体降解啤酒中T-2毒素

王小博

刘健南1

郑 琳1

陈冰冰1

冯泽君1

邓 旗2

(1. 佛山职业技术学院,广东 佛山 528137;2. 广东海洋大学食品科技学院,广东 湛江 524088)

T-2毒素是由镰孢菌属真菌产生的一种次级代谢产物,是毒性最强的一种A型单端孢霉烯族化合物毒素。其在自然界中分布广泛,常常污染粮谷类产品及其制品,在大麦、小麦、玉米等粮农作物以及动物饲料中污染率高达80%以上[1]。徐哲等[2]研究发现,180份中国小麦样品中镰刀菌毒素检出率高达95%。T-2毒素具有很强的致毒效应,机体长期低剂量摄入可导致血液及淋巴系统受到侵害,造成内分泌紊乱及免疫功能下降等,严重影响人类健康[3-5]。广东省年平均气温较高、湿度较大,粮谷作物在放置过程中极易发霉变质,产生真菌毒素,尤其是大麦、小麦变质后极易产生T-2等真菌毒素。

辉光放电等离子体(glow discharge plasma,GDP)是一种新型的、绿色环保的电化学高级氧化技术,也是一种能够在水溶液中通过直流放电产生等离子体的非热处理技术[6-7]。GDP是指在封闭的容器内施加一定的电场促使其不断产生具有强氧化性的高活性粒子(·OH、H2O·、H2O2等),溶液中的有机物在光、电等媒介下可与生成的高活性粒子发生反应,并最终彻底分解为CO2、H2O和简单无机盐,具有降解效率高、能耗低、操作简单、不产生二次污染等特点[8],已被广泛应用于水体中有机污染物的消解[9],但将其用于啤酒中 T-2毒素的降解及其对啤酒品质影响的研究尚未见报道。研究拟构建GDP降解装置,考察GDP条件对啤酒中T-2毒素的降解效果,探讨GDP降解T-2毒素的最佳工艺条件;并分析GDP对啤酒理化指标的影响,为GDP脱除食品中真菌毒素的研究与应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

T-2毒素标准品:纯度≥98%,上海颖心实验室;

甲醇、乙腈:色谱纯,纯度≥ 99.9%,南京化学试剂股份有限公司;

甲酸、乙酸乙酯:分析纯,天津光复试剂有限公司;

乙酸铵:阿拉丁试剂(上海)有限公司;

青岛啤酒:市售。

1.2 仪器与设备

辉光放电降解装置:实验室自主构建(图1);

图1 辉光放电降解装置结构示意图

超高效液相色谱—三重四极杆质谱联用仪:TSQ Quantiva型,美国Thermo Fisher公司;

电子天平:FA1104A型,上海精天电子仪器有限公司;

涡旋震荡仪:Vortex 2型,德国IKA公司;

冷冻离心机:KT7-900-429型,新加坡KENTA公司;

氮吹仪:YT-D24型,山东云唐智能科技有限公司;

超声波提取器:KQ-800B型,昆山舒美超声仪器有限公司;

全自动啤酒分析仪:5611型,长沙市驭仪电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 含T-2毒素样品的制备 取10 mg T-2毒素标准品,用乙腈溶解、定容配制成质量浓度为100 μg/mL的T-2毒素标准储备液。分别取0,1,3,5,7,10 mL标准储备液于100 mL容量瓶中,啤酒定容,得到质量浓度分别为0,1,3,5,7,10 μg/mL的含T-2毒素的啤酒溶液。

1.3.2 GDP降解啤酒中T-2毒素工艺参数优化

(1) 单因素试验:取10 mL含T-2毒素的啤酒于反应器中,在基础条件(电压550 V,时间15 min,电流100 mA,T-2毒素初始质量浓度5 μg/mL)下分析GDP装置放电电压、作用时间、放电电流和T-2毒素初始质量浓度对T-2毒素降解效率的影响。其中,放电电压为400,450,500,550,600 V,作用时间为1,3,5,7,10 min,放电电流为5,10,15,20,25 mA,T-2毒素初始质量浓度为1,3,5,7,10 μg/mL。每组试验重复3次,测定并计算T-2毒素降解率。

(2) 响应面试验:在单因素试验基础上,采用Design-Expert 8.06 软件的Box-Behnken设计原对GDP降解啤酒中T-2毒素的参数进行四因素三水平的响应面优化。

1.3.3 T-2毒素降解率测定 参照Tahoun等[10]的方法并修改。T-2毒素标准曲线为y=207.9x+330.62,R2=0.999 2。按式(1)计算 T-2毒素降解率。

(1)

式中:

R——T-2毒素降解率,%;

C0——T-2毒素初始质量浓度,μg/mL;

CT——经GDP降解后T-2毒素的质量浓度,μg/mL。

1.3.4 GDP对啤酒理化指标的影响 取10 mL啤酒于反应器内,以响应面优化得到的参数为试验条件,对啤酒进行GDP处理。GDP处理后,采用啤酒全自动分析仪器法[11]分别测定啤酒的酒精度、色度、pH、原麦汁浓度、浊度、泡持性、总酸度、双乙酰、苦味值等[12]。

1.3.5 数据处理 采用SPSS 19.0软件对试验数据进行统计分析,采用Origin 8.5 软件绘图,采用Design-Expert.V 8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 放电电压 由图2可知,GDP放电电压与T-2毒素降解率呈正比,随着放电电压的增加,T-2毒素降解率也随之增加;当放电电压为500～600 V时,T-2毒素降解率逐渐趋于平缓;与400,450 V相比,放电电压为500,550,600 V时,T-2毒素降解率增加显著(P<0.05)。放电电压对活性粒子(·OH、·H、H2O2)的产生有显著影响,当放电电压较低时,阴极发射的电子在电场中加速获取的能量较低,从而与阳极尖端气态水分子发生碰撞,激发气态水分子发生电离产生的活性粒子较少,最终导致等离子体对T-2毒素的降解效果较弱[7,13]。电压升高,辉光增强,产生的·OH、·O、·H、H2O2等高活性粒子浓度增加,促使T-2毒素氧化降解效果增强[14]。当活性物质浓度达到一定程度,T-2毒素转化的反应也逐渐趋于饱和达到平衡状态[15],与试验结果一致。综上,GDP降解T-2毒素的放电电压控制在 500～600 V较为适宜。

*表示组内比较差异显著(P<0.05)

2.1.2 作用时间 由图3可知,随着作用时间的延长,T-2毒素的降解率逐步增大;当作用时间>10 min时,T-2毒素降解率虽有增加,但增幅较小;与1,5 min相比,作用时间为10,15,20 min时,T-2毒素降解率显著增加(P<0.05),说明在0～10 min内,辉光放电等离子体中的活性物质主要与T-2毒素发生反应;而10 min后,T-2毒素与活性粒子反应逐渐达到饱和,因此T-2毒素降解速率缓慢。此外,由于反应过程中产生的中间产物消耗了部分活性物质,致使与T-2毒素发生反应的·OH减少[16],反应速率随着作用时间的延长而减小。因此,GDP降解T-2毒素的作用时间保持在 10～20 min 比较适宜。

*表示组内比较差异显著(P<0.05)

2.1.3 放电电流 由图4可知,随着放电电流的增加,T-2毒素降解率呈先升高后下降趋势。当放电电流为90 mA时,T-2毒素降解率达到最大,为83.29%;与30,50 mA相比,放电电流为70～110 mA时,T-2毒素降解率显著增加(P<0.05)。提高放电电流,输入体系的功率增加,电极间的电场强度增强,形成了较大的微放电密度,电子在电场中获得更多的能量,加速了高能电子的形成。高能电子产生的速率和数量升高,轰击能力加强,从而使水分子和气体分子等更快更多地离解和电离,生成更多的活性物质[17]。过高的放电电流,阳极铂丝易被熔化损坏,最终造成毒素降解率下降。因此,放电电流控制在 90～110 mA最为适宜。

*表示组内比较差异显著(P<0.05)

2.1.4 T-2毒素初始质量浓度 由图5可知,当T-2毒素初始质量浓度≤7 μg/mL时,随着初始质量浓度的增加,T-2毒素降解率随之增加;当T-2毒素初始质量浓度>7 μg/mL时,随着初始质量浓度的增加,T-2毒素降解率增加幅度减缓;与其他质量浓度相比,初始质量浓度为7,10 μg/mL时,T-2毒素降解率增加显著(P<0.05),说明在一定质量浓度范围内,溶液的初始质量浓度越大,毒素降解效果越好,与Pu等[18]的结论一致。T-2毒素的初始质量浓度越高,与·OH等发生有效碰撞的概率越大,毒素降解越快。初始质量浓度增大也会增加溶液的电导率,抑制放电过程中流光的形成,使产生的·OH量减少而抑制T-2毒素的降解[19]。因此,T-2毒素初始质量浓度控制在5～10 μg/mL有利于反应的进行。

*表示组内比较差异显著(P<0.05)

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计及结果 以放电电压、作用时间、放电电流、T-2毒素初始质量浓度为自变量,T-2毒素降解率为响应值,设计四因素三水平响应面试验,试验因素水平见表1,试验设计及结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 模型拟合与分析 采用方差分析(ANOVA),二阶多项式模型来计算预测的响应,得到啤酒中T-2毒素降解率对放电电压、作用时间、放电电流和T-2毒素初始质量浓度的回归模型方程:

Y=82.68+4.38A+9.26B+5.89C+8.84D-1.62AB+0.095AC+2.63AD+2.8BC-6.46BD-2.49CD-5.54A2-7.15B2-4.97C2-7.25D2。

(2)

表3 方差分析

2.2.3 响应面分析 由图6可知,随着作用时间与T-2毒素初始质量浓度的升高,T-2毒素降解率呈先增加后减小的趋势,且曲面陡峭程度明显;同时,随着作用时间与放电电流的升高也出现了类似的趋势,表明放电电流与T-2毒素初始质量浓度、放电电流的交互作用显著(P<0.05)。

图6 各因素交互作用的响应面图

2.3 验证实验

经Design-Expert.V 8.0.6软件计算得到GDP对啤酒中T-2毒素的最佳降解参数为放电电压572.934 V,作用时间18.072 5 min,放电电流99.236 1 mA,T-2毒素初始质量浓度8.334 4 μg/mL。根据实际情况,调整最佳降解条件为放电电压570 V,作用时间18 min,放电电流99 mA,T-2毒素初始质量浓度8.5 μg/mL。在此条件下重复5次,T-2毒素降解效率为89.21%,与预测值89.37%接近,因此该响应面优化模型得到的GDP对T-2毒素最佳降解条件准确且有效。

2.4 GDP对啤酒品质的影响

啤酒的质量由其酒精度、原麦汁浓度、泡持性、双乙酰含量、苦味值等指标共同决定[20],不同的工艺会对啤酒的理化指标产生巨大影响[21]。由表4可知,经GDP处理后,啤酒的酒精度、pH值和泡持性均略微下降,色度值、浊度值、苦味值、双乙酰含量和总酸含量略微上升,原麦汁浓度不变;与对照组相比,泡持性下降显著(P<0.05)。啤酒泡持性主要表现在啤酒的起泡性、持久性和附着性方面,是判别啤酒品质的重要因素,能够直观评价啤酒质量好坏,其主要受到CO2、泡沫蛋白和异α-酸等因素的影响[22]。经GDP处理后,啤酒中部分CO2发生逸散、泡沫蛋白发生分解,进而导致其泡持性下降。双乙酰是啤酒发酵过程中的重要代谢产物之一,是啤酒成熟与否的重要标志。啤酒中双乙酰含量必须<0.10 mg/L,若超过0.2 mg/L,就会产生饭馊味,严重影响啤酒品质[23]。双乙酰是从α-乙酸乳酸转化中获得的,GDP处理可促使少量α-乙酸乳酸转化,导致双乙酰含量上升。

表4 GDP处理对啤酒品质的影响†

啤酒中含有的酸类达200多种,这些酸及其盐类控制着啤酒的pH值和总酸含量,适合的酸味会赋予啤酒柔和的口感[24]。啤酒中原有的一部分酸与啤酒中存在的金属离子相结合[25],经GDP处理后有机酸解离出来,进而导致啤酒pH下降、总酸含量上升。原麦汁浓度主要反映发酵前麦芽汁中含有的可发酵糖含量,是鉴定啤酒品质的一个硬性指标。酒精度、苦味都是影响啤酒口味的重要口感指标,浊度可以直接影响其外观质量和非生物稳定性,啤酒的颜色更是评定啤酒质量的一项重要指标。啤酒经GDP处理后各指标均符合国标。综上,经GDP处理后啤酒中各项理化指标虽然会发生改变,但对啤酒品质影响较小。因此,将GDP降解装置应用于啤酒生产,能够有效降解原料中的T-2毒素,保障产品安全。

3 结论

辉光放电等离子体降解T-2毒素的最佳工艺条件为放电电压570 V,作用时间18 min,放电电流99 mA,T-2毒素初始质量浓度8.5 μg/mL,此条件下T-2毒素降解率可达89.21%。经辉光放电等离子体处理后,啤酒的泡持性显著降低(P<0.05),其他指标无明显变化。后续可将辉光放电等离子体降解T-2毒素的工艺应用至果汁加工及其他真菌毒素的消解中。