豚鼠源马链球菌兽疫亚种的分离鉴定

李艳红 , 白和平 , 信玉春 , 郭柯宇 , 王金锋 , 夏力亮 , 吴同垒 , 史秋梅

(1.乐亭县农业农村局 , 河北 唐山 063699 ; 2.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室 , 河北 秦皇岛 066604 ; 3.河北省廊坊市永清县农业农村局 , 河北 廊坊 065600 ;4.河北硕博畜牧服务有限公司 , 河北 唐山 063500)

豚鼠(Guinea pig)属啮齿目、豚鼠科、豚鼠属,又名荷兰鼠、荷兰猪等,是一种集皮毛、观赏和滋补等多种用途于一身的食草动物,其肉质鲜美、口感丰富、蛋白含量高、脂肪和胆固醇含量低[1],在厄瓜多尔、哥伦比亚和秘鲁等国家被视为重要的蛋白质来源。豚鼠体型紧凑、外形呆萌可爱,英国等欧洲国家视豚鼠为主要的伴侣动物,加上其生长快、成本低、产仔多、对外界抵抗力强、成活率高和适应性强等特点,已成为重要的特种经济动物。

马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)属乳杆菌目、乳杆菌科、链球菌属,为兰氏分菌的C 群 β 溶血链球菌,为革兰阳性球菌,是链球菌病的主要病原体之一[2-4],可感染多种宿主,如猪、马、牛、驴、羊、鸡、犬、猕猴和豚鼠等,一般通过食物污染或与感染动物接触感染人。马链球菌兽疫亚种在我国主要感染猪,临床表现为关节炎、败血症、肺炎和脑膜炎;感染马、牛、驴、羊的临床症状主要为发热、上呼吸道黏膜发炎、颌下淋巴结肿胀、化脓和子宫炎等[5-6];感染家禽主要表现为气囊炎和支气管栓塞[7];感染犬呈严重的纤维性渗出和出血性肺炎[8];猕猴感染后表现为出血性败血病变[9]。2021年10月,河北省唐山市某豚鼠养殖场45日龄豚鼠出现精神沉郁、食量下降、眼角有脓性分泌物、消瘦和头部肿大等临床症状,经兽医师诊断为继发性脑膜炎。经一系列检测判定为细菌感染致豚鼠发病,通过细菌的分离培养,得到1株马链球菌兽疫亚种优势菌,对分离菌株进行中药和西药敏感性试验及致病性试验,以期为临床马链球菌兽疫亚种的防治和新型兽药的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源和实验动物 河北省唐山市某豚鼠养殖场发病豚鼠,无菌棉拭子蘸取其眼角脓性分泌物,4 ℃送至河北省预防兽医学重点实验室;4～6周龄健康SPF级BALB/c小鼠,体重25 g,购自北京维通利华实验技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2016—0002。

1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂,购自北京奥博星生物科技有限公司;胎牛血清,购自浙江天杭生物科技有限公司;血琼脂培养基,购自郑州安图生物科技有限公司;细菌微量生化鉴定管,购自北京路桥技术有限责任公司;0.4%氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色液和抗菌药药敏纸片,均购自北京索莱宝科技有限公司;中药(竹叶紫胡、苦地丁、使君子、蒲公英、苦参、薄荷、金银花、黄芩、路边青、大青叶、干姜、紫花地丁、丁香叶、千里光、连翘、甘草、穿心莲、黄柏和马鞭草),均购自秦皇岛民乐药店。

1.3 主要仪器 PCR扩增仪,购自杭州朗科学仪器公司;电子多功能煲,购自潮州中雄家用电器厂。

1.4 试验方法

1.4.1 细菌的分离纯化和形态学观察 在超净台中取出棉拭子在血琼脂培养基上均匀涂布,37 ℃培养箱培养24 h,挑取优势菌落纯化培养至形态单一。取纯化后的细菌培养物进行革兰染色,油镜下观察分离菌株的染色特性和菌体形态。

1.4.2 分离菌株的生化鉴定 将分离菌株的纯化培养物接种于细菌微量生化鉴定管中,37 ℃培养 24 h,记录分离菌株对七叶苷、菊糖和山梨醇等10项生化反应的结果,并与《伯杰氏系统细菌学手册》(第8版)的生化结果进行比较。

1.4.3 分离菌株16S rRNA基因鉴定 采用热裂解法提取分离菌株的DNA,将其作为PCR模板,利用16S rRNA通用引物(F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增分离菌株的16S rRNA基因,PCR扩增体系和扩增程序参照参考文献[10]进行,PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化并测序,测序结果在NCBI中进行BLAST比对,并构建系统进化树。

1.4.4 药敏试验 采用K-B试纸法检测分离菌株对24种临床常用抗菌药的敏感性,用灭菌棉签蘸取适量菌液,均匀涂布于含5%胎牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂培养基上,将药敏纸片贴在培养基表面,37 ℃培养箱培养24 h,测量抑菌圈直径,依据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的药敏试验标准,根据抑菌圈直径大小判定结果,试验重复3次取平均值。

1.4.5 中药提取液的制备 将19种中药粉碎,分别精确称取10 g加入250 mL烧杯中,加入200 mL超纯水浸泡4 h,使用电子多功能煲煮至沸腾,70 ℃煎1 h,用400目滤网过滤,药渣中再添加200 mL超纯水继续煎熬、过滤,操作步骤同上,将2次所得药液合并后70 ℃浓缩至10 mL,即药液的终浓度为1 g/mL,将药液经0.45 μm滤膜过滤后4 ℃保存,备用。

1.4.6 中药最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定 参照参考文献[10]方法,用试管二倍稀释法检测19种中药对分离菌株的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)值和最小杀菌浓度(Minimal bactericidal concentration,MBC)值,取12支试管,标号为1～12,每支试管先添加2 mL 含5%胎牛血清的胰蛋白胨大豆培养基,再加入2 mL中药提取液至1号试管,混匀后吸取2 mL液体加入2号试管,依次倍比稀释至10号试管后弃2 mL液体;最后1～10号试管再加入20 μL分离菌菌液,11号试管加20 μL分离菌菌液作为阳性对照,12号试管加20 μL超纯水作为阴性对照,所有试管均于37 ℃ 培养24 h,加入10 μL 0.4% TTC染色液,37 ℃继续培养30 min,如有大量活菌存在,TTC染色液则被还原为红色,以培养液颜色未变化的最小药物浓度为该药的MIC值。每支试管取50 μL培养物接种于血琼脂培养基,37 ℃培养24 h,以无菌生长的最小药物浓度为该药的MBC值。每种中药重复进行3次试验,取平均值。

1.4.7 动物回归试验 将10只小鼠随机分为对照组和感染组,感染组每只小鼠腹腔注射0.2 mL分离菌菌液,对照组注射等剂量的灭菌PBS,每天观察小鼠状况,及时剖检死亡小鼠,观察小鼠脏器变化,同时取病变脏器涂抹血琼脂培养基,进行细菌纯化鉴定。

2 结果

2.1 分离菌株的形态特征和生化鉴定 分离菌株在血琼脂培养基上呈透明、凸起状小菌落,呈现明显的β溶血现象;革兰染色呈阳性、圆球菌,少数为单个或成对存在,多为3～5个连接、呈短链状,与链球菌的生长特性和形态特征相似。生化鉴定结果显示,该分离菌株不能发酵菊糖和阿拉伯醇,能发酵山梨醇、海藻糖、乳糖、甘露醇和棉籽糖,能水解水杨苷,不能水解七叶苷,马尿酸钠试验为阴性,与马链球菌兽疫亚种的生化特性相符,初步鉴定该分离菌株为马链球菌兽疫亚种,并将其命名为MLQJ-1。

2.2 分离菌株的16S rRNA基因鉴定 经PCR扩增MLQJ-1的16S rRNA基因,得到1 500 bp左右的预期条带(图1);MLQJ-1 16S rRNA基因测序结果拼接后,经NCBI网站BLAST比对,MLQJ-1 16S rRNA测序结果与马链球菌兽疫亚种的16S rRNA序列同源性达99.72%;MLQJ-1 16S rRNA基因的系统进化树如图2所示,MLQJ-1与马链球菌兽疫亚种Bd 19/03株自然聚为一支,与1株马链球菌和7株马链球菌兽疫亚种处于同一小分支,与葡萄球菌处于不同分支,与沙门菌和大肠杆菌相距较远。结合形态特征、生化鉴定和16S rRNA序列分析结果,判定MLQJ-1为马链球兽疫亚种。

图1 分离菌株16S rRNA基因的PCR扩增

图2 基于分离菌株16S rRNA基因所构建的系统进化树

2.3 药敏试验 测量各种抗菌药的抑菌圈直径,判断MLQJ-1对24种抗菌药的敏感性,结果如表2所示,分离菌株对氨苄西林、头孢曲松、阿莫西林、氟苯尼考、土霉素、头孢噻呋、恩诺沙星和青霉素敏感,对环丙沙星、替米考星、磺胺间甲氧、黏杆菌素、林可霉素和大观霉素中介,对阿米卡星、新霉素、卡那霉素、多西环素、乙酰甲喹、磺胺二甲氧、复方新诺明、庆大霉素、马波沙星和氧氟沙星耐药。

表1 抗菌药药敏试验结果

表2 中药药敏试验结果

2.4 中药MIC值和MBC值测定 经试管二倍稀释法测定19种中药对MLJQ-1的MIC值和MBC值,结果如表2所示,苦地丁、苦参、黄芩和千里光的MIC值介于1.9～15.6 mg/mL,竹叶紫胡、使君子、蒲公英和薄荷等15种中药的MIC值介于62.5～125 mg/mL;苦地丁、苦参、黄芩和千里光的MBC值介于1.9～31.2 mg/mL,竹叶紫胡、使君子、蒲公英和薄荷等15种中药的MBC值介于62.5～250 mg/mL。

2.5 动物回归试验 感染8 h后,感染组小鼠行动迟缓、双目紧闭、精神沉郁、震颤、被毛逆立、四肢抽搐,与豚鼠发病症状相似;24 h内感染组小鼠全部死亡,剖检可见小鼠心脏、肝脏和脾脏出血,从死亡小鼠脾脏可分离出与马链球菌兽疫亚种形态结构、生长特性和生化鉴定结果一致的细菌;对照组小鼠无死亡,7 d 后全部处死进行检测,并未检测到马链球菌兽疫亚种。结果表明,MLJQ-1具有较强毒力,可致小鼠死亡。

3 讨论

本试验对发病豚鼠眼角脓性分泌物病料进行检测,分离到1株呈现明显溶血的优势菌,通过形态学观察、生化鉴定和16S rRNA序列分析确定为马兽疫链球菌亚种。从临床症状来看,发病豚鼠精神不振、体温升高、眼睑有化脓性炎症、眼结膜充血、头部逐渐肿大,与余思义等[11]、张晓佩等[12]观察到的马链球菌兽疫亚种引起豚鼠眼部感染的临床症状相似。

抗菌药一直被视为治疗链球菌的首选药物,本试验中抗菌药药敏试验结果显示,分离菌株对新霉素、卡那霉素、多西环素和复方新诺明等10种抗菌药耐药;蒲小峰等[13]研究发现,驴源兽疫链球菌对青霉素和四环素耐药;程龙飞等[9]研究发现,新疆猕猴源马链球菌对青霉素、新霉素和四环素等耐药;苗立中等[14]研究发现,巴拿马香猪源马链球菌兽疫亚种对青霉素、四环素和复方新诺明有明显耐药性。以上研究表明,不同地区、不同宿主马链球菌兽疫亚种的耐药性相似,青霉素、四环素、新霉素和复方新诺明等不宜继续作为临床常用药用于治疗马链球菌兽疫亚种引起的感染,长期使用抗菌药会增加耐药性和兽药残留,甚至危害生态平衡。

本试验结果显示,分离菌株对氨苄西林、阿莫西林和青霉素等8种抗菌药敏感;陈峰等[15]研究Hartley豚鼠源马链球菌兽疫亚种发现,分离菌株对青霉素、阿莫西林和氨苄西林敏感,与本试验结果一致;唐海波等[16]分离的黑豚鼠源马链球菌兽疫亚种同样对氨苄西林敏感;钟映梅等[17]的研究结果也与此一致,提示氨苄西林可以作为治疗马链球菌兽疫亚种感染的首选药物。但该药也易产生耐药性,因此需加快研制低耐药、高效、低毒、安全的药物,用于马链球菌兽疫亚种感染的防治。

值得注意的是,本试验首次对分离菌株进行了中药体外抑菌试验,中药MIC值和MBC值的测定结果显示,苦地丁、苦参、黄芩和千里光对本试验所分离马链球菌兽疫亚种的MIC值介于1.9～15.6 mg/mL,MBC值介于1.9～31.2 mg/mL,竹叶紫胡、使君子、蒲公英、薄荷、金银花和路边青等15种中药的MIC值介于62.5～125 mg/mL,MBC值介于62.5～250 mg/mL。结果表明,所选19种中药水煎剂都具有较强的抑菌和杀菌作用,临床应用所选中药进行治疗也应具有较好的疗效。中药不仅可以预防和治疗病原菌引起的感染,还具有降低饲养成本、减少药物残留、建立特色养殖体系等潜在优点。

马链球菌兽疫亚种感染的临床治疗过程中,在选择敏感药物治疗发病动物的同时,应隔离患病动物,减少病原菌在种群之间传播;加强饲养管理,保持饲养舍清洁卫生、干燥通风,减少病原菌的孳生;粪尿、残余饲料和患病死亡动物等及时进行无害化处理,防止其成为传染源;避免直接或间接传染给人类,对人类健康造成潜在威胁。