和枢消积丸对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及肿瘤组织VEGF、PDGF蛋白的影响*

陈相霖 汪 静 朱晓宁 张玉蓉 彭昭宣

1.西南医科大学中西医结合学院 (四川 泸州, 646000) 2.西南医科大学附属中医医院肝胆病科

肝细胞癌(以下简称肝癌)是原发性肝癌的主要组织学类型,是全球第七大常见癌症,也是第三大癌症相关死因[1]。早期肝癌可通过手术切除、消融或肝移植等进行治疗,激酶抑制剂和免疫治疗成为中晚期肝癌患者主要选择。然而肝癌患者五年的相对生存率仅18%[2]。肝癌内含有丰富血管,与新生血管生成密切相关的血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)在肝癌细胞间质中过度表达,是干预肝癌生成和发展的重要因子[3,4]。索拉非尼是被BCLC分期系统推荐用于晚期肝癌治疗的一线靶向药物,能通过抑制VEGF和PDGF在内的酪氨酸激酶受体的活性,来抑制肿瘤内部的新生血管的生成和肿瘤增殖,有效延长中晚期肝癌患者生存时间[5,6]。单一的索拉非尼治疗的患者的中位生存时间仅延长10.7月,毒副作用较大且总体预后差[7]。诸多证据证实,草药中的天然化合物具有多活性成分、多靶点和低毒性等优点,是抑制恶性肿瘤的理想候选者,逐渐被选为全球手术、化疗和放疗后癌症患者的补充和替代疗法[8]。

研究团队总结临床肝癌治疗经验创制的和枢消积丸已获国家专利并成为院内制剂。前期细胞实验表明,和枢消积丸可抑制人肝癌细胞增殖、迁移,促进肝癌细胞凋亡[9]。因此,本研究通过构建H22皮下异位肝癌动物模型,观察和枢消积丸对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用,初步探讨其抗肝癌机制, 积极寻找有效抗肝细胞癌的中西结合治疗方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物:雄性BALB/c小鼠,清洁级,鼠龄5～6周,体重18～20 g,来源于成都生物实验动物有限公司(生产许可:四川SCXK2020-034)。细胞株:小鼠肝癌腹水瘤细胞系H22细胞(中国碧云天公司)。实验药物:和枢消积丸由西南医科大学附属中医医院药剂科提供,中药材的煎剂、提取、浓缩由西南医科大学附属中医院制剂科完成,根据人与动物之间表面积的转换比进行剂量转换[10]。索拉非尼购自北京索莱宝科技有限公司(生产批号222B024)。主要试剂:HE染色试剂盒购自北京索莱宝公司(批号G1120),VEGF抗体、PDGF抗体购自美国Abcam公司(批号ab51745、ab23914),β-Actin抗体购自北京索莱宝公司(批号K0218),天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)均购自南京建成生物工程(批号C009-2、C010-2)。

1.2 实验方法 随机分组,实验组30只小鼠均在右腋窝皮下注射200 μl H22细胞悬液(4.5×106个/ml),空白组小鼠5只不做特殊处理。第3天触及直径达2～4 mm的瘤体则造模成功。将30只H22荷瘤小鼠随机分为6组(每组5只):模型组、中药低剂量组(1.37 g/kg和枢消积丸)、中药中剂量组(2.73 g/kg和枢消积丸)、中药高剂量组(5.46 g/kg和枢消积丸)、索拉非尼组(30 mg/kg索拉非尼)、联合组(30 mg/kg索拉非尼联合5.46 g/kg和枢消积丸)[11],持续灌胃14 d。实验期间,每3 d测量1次肿瘤大小,计算肿瘤体积,肿瘤体积=(长度×宽度2)/2。实验结束剥离瘤体,测量瘤重,计算抑瘤率,抑瘤率=治疗后瘤重/模型组瘤重。新鲜瘤组织固定并脱水,通过HE染色观察肿瘤细胞病理改变。测量小鼠肝功能(AST、ALT水平)。通过免疫组化和Western Blotting法检测各组小鼠肿瘤组织中VEGF、PDGF蛋白表达。

2 结果

2.1 H22荷瘤小鼠的生命活动和体重变化 模型组和索拉非尼组小鼠出现明显食欲不振、运动缓慢、精神状态低下、腹泻等症状;联合组小鼠运动敏捷,精神状态、食欲良好且大便正常。各组小鼠实验前后体重比及各组间体重比较均差异无统计学意义,见表1。结果表明,和枢消积丸具有提高H22荷瘤小鼠生活质量和改善索拉非尼毒副作用的潜能,且对小鼠体重无明显影响。

表1 H22荷瘤小鼠体重变化情况

2.2 H22荷瘤小鼠异位瘤体积和瘤重 见表2。结果表明,和枢消积丸具有单独抑制肝癌生长和增殖的能力,与索拉非尼联用时效果最佳。

表2 实验小鼠H22异位瘤体积及瘤重变化情况

2.3 H22荷瘤小鼠肝功能变化 见图1。结果表明,和枢消积丸具有改善肝功能、减缓肝损伤的功效,与索拉非尼联用效果优于单用索拉非尼。

与模型组比较,*P<0.01

2.4 H22皮下异位瘤组织学变化 模型组小鼠的肿瘤细胞排列紧密,细胞膜较完整;中药低、中、高剂量组小鼠的肿瘤细胞均发生不同程度的破裂和坏死,与剂量呈正相关;联合组小鼠的肿瘤细胞内结构紊乱明显。各组小鼠病理组织结构紊乱程度与肿瘤增长指数趋势负相关。见图2。结果表明,和枢消积丸能破环肿瘤细胞内部结构,具有抑瘤作用,并且能够提高索拉非尼抑制肝癌细胞增殖和发展的潜力。

图2 H22荷瘤小鼠瘤组织病理结构改变(HE,200×)

2.5 H22皮下异位瘤的VEGF和PDGF蛋白表达 与模型组比较,各治疗组小鼠瘤组织的VEGF和PDGF蛋白表达均下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。免疫组化实验显示,VEGF和PDGF阳性细胞的数量与和枢消积丸的剂量呈负相关。与单用和枢消积丸或索拉非尼比较,联合治疗时瘤组织VEGF和PDGF表达下降最为明显(P<0.01),与Western Blotting法检测结果基本一致。见图3。结果表明,和枢消积丸具有抑制VEGF和PDGF表达的中药,能够协同索拉非尼拮抗肝癌细胞增殖。

与模型组比较,**P<0.01;与索拉非尼组比较,##P<0.01

3 讨论

中医认为肝癌属于“积聚”“癌毒”等范畴,全国优秀中医临床人才、四川省名中医汪静教授基于中医学“两本三枢”理论和全国名老中医孙同郊教授“和调”学术思想,认为发病于脾、肾和少阳、少阴两枢以及脾胃中枢功能失调密切相关。“滋水涵木”“见肝之病,知肝传脾,当先实脾”,当补脾肾,顾护先后天之本。少阳为阴阳之道路、表里之枢机;少阴为人身性命之枢机,能量储存之地。脾胃处中焦,脾主升清而胃主降浊,脾升则下焦肝肾二脏之气升,胃降则上焦心肺之气降,脾升胃降斡旋一身之气机,为气机升降之枢,故“枢机利则百气转”。是以基于仲景“小柴胡汤”、张锡纯“新拟和肝丸”和《内经》“四乌贼骨一芦茹丸”融合创新,创制和枢消积丸。方中柴胡、黄芩,行小柴胡之意,调和少阳枢机,共为君药;鸡内金、麦芽两药配伍使肝气升发,胃气通降,脾气健运,共为臣药;黄芪、白术顾护后天之本,肉桂固先天之本,抑肝木横恣,茜草活血化瘀,海螵蛸疏通血脉,鳖甲软坚散结,连翘清热散结,白芍润以柔肝护肝,共为佐药;甘草以缓肝兼调和诸药,冰片、薄荷脑芳香通肝络,共为使药。诸药配伍,使气机调畅,肝胃调和,脾气得健,湿热清利,癥积自消。前期临床观察研究发现该方能够延长肝癌患者总生存期,临床疗效明确。

为研究和枢消积丸对肝癌的抑制作用及机制,我们构建了H22皮下异位种移植小鼠模型,发现各治疗组小鼠的肿瘤体积、肿瘤抑制率均显著低于模型组,联合组小鼠的抑瘤作用明显高于单用和枢消积丸或索拉非尼。实验观察到和枢消积丸可以破环肿瘤组织内部结构,协助索拉非尼减缓肝癌细胞的发展进程。不同剂量的和枢消积丸均能不同程度下调H22荷瘤小鼠AST、ALT水平,而索拉非尼组小鼠的AST、ALT水平与模型组相近,提示和枢消积丸改善肝脏功能、减缓肝损伤的作用优于索拉非尼。VEGF可与血管内皮细胞的特异性受体结合,促进血管内皮细胞增殖,同时提高微血管的通透性,为肿瘤细胞提供营养物质;PDGF可促进细胞生化和增殖,能够诱导血管内皮细胞、平滑肌细胞和肿瘤细胞的增殖和迁移[3],因此,抑制肝癌血管生成相关因子是治疗肝癌的重要途径。本文通过免疫组化和Western blotting实验,证实和枢消积丸能够抑制VEGF和PDGF表达水平,联合索拉非尼使用时效果更优。

综上所述,和枢消积丸具有抑制H22异位移植瘤生长和提高索拉非尼抗肝癌疗效的作用,机制可能与抑制血管新生相关VEGF和PDGF相关。本研究也存在局限性,H22荷瘤小鼠样本量有限,在今后的研究中还需利用体外模型、人体组织样本进一步阐明作用机制。