牦牛奶中不同酪蛋白的提取及其功能特性分析

◎ 周 静，张 鑫，陈旭雯，付 帅，王 练

（西昌新希望三牧乳业有限公司，四川 西昌 615000）

牦牛乳富含丰富的蛋白质、氨基酸、矿物质和维生素，具有易消化吸收和营养丰富等特点。牦牛乳的酪蛋白含量高，且酪蛋白组分丰富，具有良好的乳化性和发泡性。传统牦牛乳酪蛋白的分离提取主要采用沉淀法、等电点沉淀法、高效液相色谱分离等方法，存在产率低、工艺复杂、分离效果不理想等问题，难以满足工业化生产的需求。因此，本研究旨在为特色乳制品的深度开发和利用提供参考[1]。

1 实验设计与方法

1.1 实验操作步骤

1.1.1 设计α-、β-、κ-酪蛋白分离工艺流程

设计α-、β-、κ-酪蛋白分离工艺流程，是实验中的关键步骤，需要考虑原料性质、分离方法和操作条件等。①将牦牛奶样品进行初步处理，去除杂质和沉淀物，采用离心法对牦牛奶样品进行预处理，去除脂肪和大分子蛋白。②对预处理后的样品进行pH 调节，使其处于适宜的分离条件下。在分离过程中，采用钙盐沉淀法，通过添加0.1～0.5 mol·L-1的CaCl2溶液，使酪蛋白沉淀，进而实现α-、β-、κ-酪蛋白的分离。分离后的沉淀经过离心后，可得到不同酪蛋白的纯化产物。③根据实验需要，调节CaCl2的浓度，通常在0.1～0.5 mol·L-1的范围内选择合适的浓度，调节溶液的pH 为4.6～4.8，温度通常控制在4～10 ℃，以促进酪蛋白的沉淀和分离，保证实验环境的稳定性和分离效果的可靠性[2-3]。

1.1.2 进行α-、β-、κ-酪蛋白分离工艺的单因素实验

（1）调节CaCl2浓度对分离效果的考察。①准备一系列不同浓度的CaCl2溶液，浓度范围为0.1～0.5 mol·L-1，再将这些溶液分别与牦牛奶样品混合，并进行离心分离过程。②离心后，沉淀物为0.1～0.5 mol·L-1。其中，若CaCl2溶液≤0.1 mol·L-1，表明浓度过低，无法充分沉淀酪蛋白，分离效果不佳；若CaCl2溶液≥0.5 mol·L-1，表明浓度较高，会造成过度沉淀，使纯化产物中杂质含量超标，导致分离效果不佳。因此，保持CaCl2溶液浓度在0.1～5 mol·L-1，即可实现高效、纯净的酪蛋白分离。

（2）调节冷却温度对分离效果的评估。调节冷却温度范围通常在4～10 ℃。通过观察可知，当冷却温度为4 ℃时，虽然沉淀质量评分较高，但分离纯度和上清液残留物质评分较低，表明低温下酪蛋白的沉淀速度较慢，导致分离时间延长，但同时也有利于提高分离纯度；当温度为10 ℃时，虽然沉淀质量较低，但分离纯度和上清液残留物质评分较高，因为高温度加速了沉淀过程，导致较多的杂质残留在产物中；当温度在6～8 ℃时，沉淀质量、分离纯度和上清液残留物质的评分都相对均衡，分离效果更佳，既能保证较高的分离纯度，又能控制残留物质的含量。

1.2 利用SDS-PAGE 电泳方法评估牦牛奶中α-、β-、κ-酪蛋白的纯度

样品制备过程如下。①取出待分析的样品2 mg，然后放入一个容量为1.5 mL 的离心管中。按照1 ∶4的比例，向离心管中加入4 倍样品重量的纯水，使样品得以溶解。例如，如果样品为2 mg，则需要加入8 mL 的纯水。②待样品充分溶解后，从中取出20 μL 的溶液，转移到另一个离心管中。在新的离心管中，向样品溶液中加入20 μL 的β-巯基乙醇（β-ME）、15 μL 的饱和溴酚蓝溶液，用于反应和标记样品的试剂。③混合均匀后，将混合溶液置于金属浴中，设定温度为95 ℃，并进行反应处理，持续时间为10 min，处理完成后，备用样品可用于后续的分析实验中。

电泳分析牦牛奶酪蛋白组分纯度的具体步骤（见表1）。

表1 电泳分析牦牛奶酪蛋白组分纯度步骤表

1.3 测定牦牛奶酪蛋白组分的功能特性

1.3.1 溶解性的测量方法

称取2 mg 的酪蛋白样品，将其溶解在水中或者缓冲液溶剂中，在室温或者37 ℃条件下观察其溶解过程。在溶解过程中，轻轻摇晃溶液，以促进酪蛋白的充分溶解。同时，技术人员需要观察溶液的透明度和均匀性，确保酪蛋白能够完全溶解，不产生任何沉淀或凝固物。

1.3.2 乳化性的检测程序

根据实验设计和所需乳化性能，取2 mg 的酪蛋白样品，溶解于pH 5.5～7.0、1.5 mL的缓冲液中。准备1∶1的油相和水相，将酪蛋白样品溶液加入油相和水相中，轻轻搅拌使其充分混合。观察乳液10 min，看其是否形成了稳定的乳液，并详细记录乳液的外观、稳定性以及乳化度等参数[4]。

2 实验结果与分析

2.1 牦牛奶中α-、β-、κ-酪蛋白的提取与分离效果

2.1.1 钙离子浓度调节实验结果分析

一方面，α-CN 具有较多的磷酸丝氨酸基团，在碱性条件下带有更多的负电荷，与钙离子结合的能力更强。随着Ca2+浓度的增加，其与αs-酪蛋白的亲和性也增加，导致αs-酪蛋白的沉淀。另一方面，在低温条件下，β-酪蛋白往往处于游离态，温度越低分离到β-酪蛋白的可能性就越高。

2.1.2 冷却温度调节实验结果分析

随着冷却温度的降低，分子的运动减弱，导致分子间的相互作用减弱。在低温下（2 ℃）β-CN 处于游离状态，其含量较高，达到16.90 g。随着温度升高，α-CN 和β-CN 的含量逐渐降低，0 ℃时α-CN和β-CN 的含量低于2 ℃时。因此，选择2 ℃作为不同酪蛋白分离温度是合理的。此外，在温度为2 ℃、CaCl2溶液浓度为0.065 mol·L-1的条件下，也能成功分离得到αs-CN 和β-CN 组分，进一步表明选择2 ℃是适宜的。

2.2 牦牛奶α-、β-、κ-酪蛋白功能特性的分析

2.2.1 不同pH 对酪蛋白组分溶解性的影响分析

对牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白进行溶解性的研究，可以揭示它们在不同条件下的溶解行为。研究发现，随着溶液pH 的变化，牦牛奶中的酪蛋白溶解度也会发生变化。随着pH 增大，酪蛋白溶解度呈先降低后增加的趋势，达到峰值后趋于平缓。特别是在等电点附近，酪蛋白的溶解度最低。这一现象与其他研究结果相符，由于pH变化引起蛋白质的结构变性，疏水基团外露，影响与水分子的相互作用，从而影响了溶解度。另外，牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白的溶解度还受温度的影响。研究证实，在40～80 ℃之间时，温度与酪蛋白的溶解度呈负相关，其原因可能在于加热导致蛋白质分子内部的非极性基团暴露，引起蛋白分子极化和构象的改变，从而导致溶解度的下降。

2.2.2 不同pH 对酪蛋白组分乳化性的影响分析

牛乳中的α-、β-、κ-酪蛋白在不同pH 下的乳化能力表现明显的变化趋势。随着pH 从酸性到碱性的变化，乳化能力先降后升，直至趋于平缓。当pH 为2.1 时，牦牛乳中的α-、β-、κ-酪蛋白乳化能力最佳，表现较好的乳化特性。这可能是由于pH 变化导致蛋白质结构发生轻微变化，增加了静电斥力，使得疏水基团暴露增多，从而提升了乳化性能[5]。相反，在pH 为4～5 时，蛋白质的可溶性减少，影响乳化稳定性。当pH 偏离等电点时蛋白质带电，乳化液之间的相互作用有效抑制了液滴的聚集，乳化稳定性得以提高。当pH 为6.15 时，乳化稳定性达到最佳状态。

2.2.3 pH 变化对酪蛋白组分发泡性的影响分析

当pH 为2.1 时，三者的起泡性达到最佳状态；当pH 为4.26 时，泡沫稳定性表现最佳，可能是蛋白质的两性电解质性质所致。当蛋白质的电荷与溶液的pH 相近时，其带电荷为0，导致溶解性下降，从而影响了其在气－液界面的排列和展开能力，进而降低了起泡性。然而，当蛋白质的电荷偏离等电点时，其溶解性增加，分子间的自由度提高，促进蛋白质在气－液界面的快速排列和展开，从而提高了起泡性。这表明，蛋白质的电荷状态和溶解性对其在液体中的表现具有重要影响，特别是在液体界面的作用。

3 结语

本实验对牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白进行研究，观察了蛋白质在不同pH 下的溶解性变化，发现其呈现先降低后增加的规律。当pH 为2.1 时，溶解度达到最高值，与其他研究结果相符合；当温度为40 ℃时，牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白的溶解度较高，随着温度升高，溶解度逐渐降低；当pH 为2.1时，牦牛奶中的酪蛋白表现较好的乳化能力和泡沫稳定性。因此，本研究结果可以为牦牛奶蛋白质的功能特性提供重要参考，对牦牛奶产品的生产和质量控制具有指导意义。