马鼻疽诊断技术的研究现状

彭明媛,王 楠,李巧玲,张晓茜,李俊平,牛瑞燕,徐 磊*

(1.山西农业大学动物医学学院,山西晋中 030801;2.中国兽医药品监察所,北京 102600)

马鼻疽(Glanders)病原菌为鼻疽伯克霍尔德氏菌,我国称为鼻疽杆菌。该病潜伏期从数天到数月不等,临床上分为急性和慢性两种类型,主要侵害成年马匹的呼吸系统(鼻型、肺型)、淋巴系统及皮肤,以鼻腔、喉头、气管黏膜或皮肤形成鼻疽结节、溃疡和瘢痕,在肺、淋巴结或其他实质器官发生鼻疽性结节为特征[2]。该病无季节性,一年四季都可发生,使役过度、厩舍拥挤、营养不良、感冒和创伤均可诱发本病[3]。 鼻疽杆菌可通过食物、气溶胶或皮肤传播给易感宿主,并能在动物间、动物和人之间传染,但人与人之间的传播较为罕见[4]。因其具有较高的气溶胶感染风险,曾被滥用于生物战争[5]。有报道美国、日本曾有实验室人员感染马鼻疽的病例[6],2021年也发生了一起人类感染病例[7]。目前没有针对马鼻疽的商业化疫苗,患病动物若不接受抗生素治疗,其病死率很高[8]。

通过血液检测、全面扑杀阳性动物和贸易限制,西欧、北美洲、日本等大多数地区已宣布消灭了马鼻疽,亚洲、中东、非洲和南美洲部分地区依然存在[9-10]。我国已基本消灭了马鼻疽,但在2018年8月,重庆市沙坪坝区发生马鼻疽疫情[11]。该病流行的原因主要与边境贸易检疫不当有关,应加大边境口岸对马鼻疽的检疫力度。本文就马鼻疽的诊断方法进行归纳总结,为该病的诊断提供参考。

1 病原分离鉴定

该菌是一种不运动的革兰氏阴性菌,显微镜下呈两端钝圆、无芽孢、无荚膜的杆状[12],在4%甘油琼脂中形成乳白色黏性、小圆形的光滑菌落。鼻疽杆菌可从患病动物未破损或未受污染的淋巴结、皮肤结节和血液中分离,含3%甘油的脑心浸润琼脂可用来大量培养鼻疽杆菌[13]。该菌在大多数培养基上生长缓慢。BM选择性琼脂培养基可以鉴别伯克霍尔德氏菌属与其他属细菌[14],鼻疽杆菌大多能在48 h内生长良好,形成圆形、紫色、光滑、大于1 mm的菌落,可用于临床复杂环境中分离病原。

2 分子诊断技术

2.1 聚合酶链反应

鼻疽假单胞菌属具有较近亲缘关系,鼻疽杆菌和类鼻疽伯克菌临床交叉反应较高,普通检测方法无法区分,通过分子检测技术进行鉴别,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是目前运用较多的方法之一。用鼻疽杆菌趋化性motB蛋白的移码突变设计一种用荧光标记引物的传统双链PCR方法[15],具有100%的特异性,能明确区分鼻疽杆菌和类鼻疽伯克菌。一种基于2种β内酰胺酶基因设计混合引物,能鉴别类鼻疽伯克霍尔德氏菌、鼻疽杆菌和泰国芽孢杆菌的多重PCR[16],可检测6023～9561个基因组当量,具有较高特异性和敏感性。

马鼻疽的分子诊断研究结合生物信息学,不仅具有高特异性,还有利于马鼻疽流行病学的调查。将补体结合试验检测为阳性的马,分离培养得到菌株,基于aroA基因进行实时荧光定量PCR(qPCR)扩增,结果显示阳性,并结合多位点序列分型和单核苷酸多态性方法建立系统发育树,确定该菌株与中东地区分离的鼻疽杆菌具有较高亲缘关系。基于 PCR 系统进行马鼻疽分子诊断对于该病原的遗传进化关系具有重要意义,特别是在马鼻疽流行但尚未确定基因型的地区[17]。比较3种qPCR方法,通过基因比对发现一段鼻疽杆菌特有序列,并以此设计引物进行检测[18]。3种qPCR均具有良好特异性和重复性,但不同方法对结果的评判Cq值标准不一,还需临床标准样本对可疑结果进一步评估。

PCR方法具有很强的特异性,与基因组学相结合不仅可以作为有力的确诊手段,还能分析菌株的家族关系及流行特点,有利于对马鼻疽的进一步防控。但PCR反应系统的复杂性,试验环境要求较高,不适合临床快速诊断,可作为临床样本辅助诊断技术。

2.2 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术易操作、成本低、检测迅速,可作为PCR的替代方法。LAMP技术具有高特异性和灵敏度,可检测出≥250 fg的鼻疽杆菌基因组DNA和≥100个含有目标DNA序列的重组质粒[19]。该方法有望成为偏远地区代替PCR的更便捷的检测技术。LAMP 技术和实时荧光定量 PCR 技术相比,由于鼻疽杆菌基因组中存在丰富的G-C区域,并且在等温条件下的二级结构,其重复性不如实时荧光定量 PCR[20]。

3 鼻疽菌素试验

鼻疽菌素利用变态反应,通过鼻疽杆菌提纯鼻疽菌素进行点眼反应,在受感染的动物中,眼睑在1～2 d内明显肿胀,以此诊断是否感染鼻疽杆菌。点眼试验是我国《马鼻疽诊断技术》检测规程中指定的检测技术之一,该方法不仅操作简便,而且特异性及检出率高,适用于偏远地区大批次的集中检疫。对于急性、开放性及慢性的鼻疽马均具有很高的诊断价值,尤其是进行5～6 d的间断反复点眼检疫[21]。鼻疽菌素试验对急性和慢性病例阳性准确率达92%,对年迈病例诊断为阴性结果的准确率为96%。在临床老年病例中,假阳性反应可能与链球菌等感染有关[13]。对没有临床症状的慢性马鼻疽以鼻疽菌素点眼作为主要检查方法,血清学为辅助检查方法[22]。近年来,世界动物卫生组织(WOAH)已经不建议进行马匹的点眼试验,但其在临床上的应用并未减少,其实用性目前无可取代。

4 血清学诊断

4.1 补体结合试验

马鼻疽是WOAH规定的必须通报的人兽共患传染病,早期发现和控制该病,对国际贸易和当地经济至关重要。补体结合试验(complement fixation test,CFT)被列为国际贸易指定的最准确和可靠的血清学试验之一[23]。虽然在老年、妊娠或疲惫动物的血清中偶尔会出现假阴性结果,其假阳性率大约占1%(可能由于使用全细胞的粗制抗原),但补体结合试验具有极好的敏感性,能够检测临床上隐性感染、慢性感染和早期阶段,减少疾病的传播和暴发[24-25]。

4.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)被WOAH 推荐用于国际贸易中的马鼻疽检疫,不同的包被抗原表现出不同的敏感性和特异性,主要包括全菌、蛋白质和膜脂多糖等,以重组蛋白居多,表现出较强的特异性。基于重组截断鼻疽杆菌胞内运动A蛋白的间接ELISA[26],其灵敏度和特异性分别可达100%和98.88%。该方法操作简单,耗间短,结果准确,受人为因素干扰少,适用于大规模检测。通过将BCAL2737a基因表达的3种蛋白进行o-糖基化系统合成保守三糖聚糖,并选其中一种糖蛋白作为包被抗原,结果显示出100%的特异性和至少88%的敏感性[27]。基于这些保守的糖基化蛋白,表现出高度的特异性,为马鼻疽的诊断提供了新的方向。对比双抗原夹心 ELISA 方法和CFT 发现,因其特有的双抗原,其特异性为99.8%,高于 CFT 97.0%的特异性,并且具有很好的敏感性,可作为马匹贸易中血清学检测可行的替代方法[28]。

针对鼻疽杆菌脂多糖的单克隆抗体被开发用于马鼻疽 C-ELISA 抗体检测方法的建立[29],该方法具有高特异性和敏感性,能鉴别鼻疽杆菌属和其他属别的细菌,但不能区分鼻疽杆菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌,二者具有相似的临床表现、形态学和等位基因图谱。目前的ELISA检测方法不能区分二者,该方面的探索还需不断完善。

4.3 虎红平板凝集试验

虎红平板凝集试验(rose bengal test,RBT)是一种快速简单的方法,需要从鼻疽杆菌培养物中纯化抗原[30]。RBT具有和鼻疽菌素试验同等的特异性,但敏感性高于鼻疽菌素试验,RBT的敏感性约为90%,鼻疽菌素试验的敏感性为75%。鉴于RBT操作简单、快速和准确,可作为野外条件马鼻疽病诊断的一种补充试验[31]。由于在以往的研究中都用了粗抗原,因此需要用纯化的抗原(囊状抗原或脂多糖)进一步评估,尽量减少试验中出现假阳性[32]。

5 小结与展望

临床上用于检测马鼻疽的方法主要有分子生物学和血清学方法。对于根除马鼻疽,临床上以鼻疽菌素试验和补体结合试验为主。鼻疽菌素试验操作简单,成本低,虽适用于基层大规模检疫,但检测过程中花费时间较长并需要专业人员进行操作。补体结合试验为世界动物卫生组织推荐的检测方法,具有高度敏感性,虽然操作繁琐,但具有较高的灵敏度,对于马鼻疽的净化具有一定意义。酶联免疫吸附试验操作简单,具有高特异性和灵敏度,检测样本容量大,适用于临床大规模检测,提升灵敏度并通过大量临床样本进行验证,有望成为一种更适用于临床的血清学诊断技术。

没有兼具高特异性、高敏感性、低成本、又操作简单快速的适用于临床的诊断方法,新的抗体诊断方法不断出现,且显示出良好的应用前景。基于微阵列方法筛选到10种特异蛋白抗原,用间接ELISA原理和其中3种抗原建立了一种快速诊断试纸条,可在15 min内读取结果,具有与CFT同等的敏感性和特异性,适用于临床快速诊断,需大量临床样本进行验证和推广[33]。全基因组测序技术的发展并结合纳米孔测序技术为马鼻疽的诊断提供了新思路,不仅有助于精细地阐明病原体的基因组结构,而且获得的序列比PCR方法提供了更高的信息价值,对全基因组变异具有高度敏感性和准确性。为了避免与细菌分离有关的问题,采用宏基因组学方法直接从样本材料中获得测序数据为未来提供新的可能性[34]。该方法需在全球数据库的建立和共享为前提下实现。在无疫苗与合适治疗方案的情况下,需改良已有方法建立新的诊断技术,以分子生物学和血清学方法为主,研发成本低、适用性广、准确性高的诊断方法,实现对马鼻疽的精准检疫监测,减少经济损失,防止疫情扩散,保障人类和动物的健康。