猪细小病毒病研究进展

刘运超,陈玉梅,杨苏珍,魏 蔷,郝慧芳,柴书军

(河南省农业科学院动物免疫学重点实验室,河南郑州 450002)

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)主要引起母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍,已在全世界广泛流行,给全球养猪业造成巨大损失[1]。我国猪场PPV感染率可高达90%以上,该病毒常常与猪瘟病毒(Classical swine fever virus,SCFV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等混合感染[2]。本文对PPV的病原特征、流行病学、疫苗研究和防控策略进行综述,为猪细小病毒病的防控工作提供参考。

1 PPV病原特征

1.1 病毒分类与形态

PPV属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirus),细小病毒属主要包括猪细小病毒(PPV)、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)、猫泛白细小病毒(Feline white parvovirus,FPV)、人细小病毒B19 (Human parvovirus B19)等,各病毒之间具有较高同源性[3-4]。PPV属于无囊膜病毒,直径25 nm,由病毒衣壳蛋白和基因组DNA组成,病毒衣壳呈20面体等轴对称结构[5]。成熟的PPV病毒粒子呈现六角形对称结构,病毒衣壳结构的核心是3种对称轴:3重轴、5重轴和2重轴,围绕对称轴分别形成了“突起”、“峡谷样”、和“酒窝样”结构,5重轴的顶端处形成有一个孔道,是病毒基因与外界交流的通道。

1.2 PPV病毒基因组

PPV是自主复制型、单股负链DNA病毒,基因组全长约5 000 bp。基因组两端各有120～200 bp的回文序列,在3′端形成一个“Y”形发卡结构,在5′端形成一个“U”型发夹结构,这两种发卡结构与病毒的复制密切相关[6]。PPV基因组含有2个启动子p4、p38和2个开放阅读框(ORF)。p4启动子在PPV感染细胞后首先启动,驱动R1、R2转录本的合成和5′端Cap结构的形成,并合成NS1和NS2蛋白。NS1蛋白与启动子p38结合,并合成R3转录本和Cap结构,R3转录本通过选择性剪接编码VP1或VP2和SAT蛋白[7]。PPV ORF1编码非结构蛋白NS1和NS2,大小分别为84 ku和18 ku,这两个蛋白均参与了病毒DNA的复制和调节。其中,NS1蛋白参与ATP结合、水解等酶促反应,具有解旋酶功能,同时该蛋白与p38启动子结合调节病毒DNA转录。

1.3 PPV衣壳蛋白

ORF2编码PPV的衣壳蛋白VP1、VP2,蛋白分子量分别为83 ku和64 ku。衣壳蛋白VP1和VP2具有共同的C端氨基酸序列,VP2蛋白由VP1蛋白通过mRNA选择性剪接而产生[8]。因此,VP1蛋白的N端氨基酸序列与VP2蛋白完全相同,另外包括一段的150aa序列。衣壳蛋白VP3是VP2蛋白翻译后修饰的产物,由VP2蛋白N端水解约25aa后产生,大小约60 ku。VP1蛋白参与病毒感染,其构象结构的改变对PPV的感染具有重要影响。VP2蛋白与受体的识别、病毒吸附、进入等关系密切,且单独的VP2蛋白,具有自组装形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)的特性,具有凝血活性,可诱导机体产生免疫保护性应答[9]。VP3蛋白作为衣壳蛋白的支架,参与VLP的形成和维持病毒的稳定性。

VP2蛋白是PPV的主要衣壳蛋白,在病毒衣壳中占60%以上,含有病毒重要的中和抗原表位,是主要的免疫原性蛋白。有人筛选12株识别PPV和PPV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,其中6株为识别线性B细胞表位的单抗,6株为识别构象型表位的单抗,且2株构象型单抗8E11和10A9具有中和标准毒株PPV7909的能力,中和效价可达到1∶2 048和1∶1 024[10]。该研究对PPV VP2蛋白的线性B细胞抗原表位进行鉴定,发现89ESGVAGQMV97是抗体识别的一个优势表位。丙氨酸突变研究结果显示,89E、90S、91G、92V和94G是参与抗体识别的关键氨基酸位点。该表位位于病毒衣壳表面,具有较高的抗原指数,但亲水性较弱,在91G、92V和93A处容易发生突变。

2 PPV流行病学

2.1 PPV的传播

PPV在全世界广泛分布,无明显发病季节,可感染各品种和年龄段的猪,后备母猪的发病率高于经产母猪。该病的传染源主要是发病猪的粪便、分泌物、尸体,发病公猪的精液,被污染的饲料、水和用具等。PPV在环境中高度稳定,患病猪的猪舍在空置数月之后仍能引起病毒扩散[11]。PPV患病猪的血清、肝、肺、腹股沟淋巴结、脾和肾脏均可检测到病毒核酸[12]。豚鼠也是PPV的易感动物,感染病死率可达100%。

2.2 PPV感染的临床特征

PPV感染的主要临床症状是初产母猪的流产、死胎和木乃伊胎等,其次是仔猪的肠炎、呼吸道病变等;亚临床感染与动物的性别和年龄无关,但可在初次感染后5～10 d内观察到中度的、短暂的淋巴细胞降低[13]。依据PPV致病力的差异,将PPV毒株划分为4类[14]:①PPV弱毒株,以NADL-2为代表,口服无法穿过母猪的胎盘屏障,不会形成病毒血症,是相对安全的弱毒疫苗株;②PPV强毒株,如NADL-8、IAF-76,能穿过胎盘屏障,引起病毒血症从而导致胎儿感染PPV;③仔猪皮炎型毒株,如Kresse株;④肠炎型毒株,与仔猪的肠道病变密切相关。

PPV感染通常不能在育肥猪上引起明显的临床症状,但是胎儿的病变程度和感染结果取决于母猪感染时的妊娠日龄和毒株种类。流行病学研究表明,PPV感染的时间点位于母猪怀孕日龄70 d之前,会导致母猪生殖失败;70 d后感染,仍存在胎盘感染的可能性,但胎儿由于受到母源抗体的保护,通常在感染后可存活。怀孕母猪通过自然或口服的途径初次感染PPV,病毒垂直传播到胎儿需要12～18 d,而通过肌肉注射病毒感染的时间则更短[15]。因此,妊娠56 d后母猪感染PPV通常不会对胎儿造成损伤。除了感染时间,毒株的毒力与胎儿的病变程度密切相关,NADL-2和PPV-IDT等低致病性毒株,不会穿过胎盘屏障,因此不能像高致病性毒株直接检测到对仔猪的危害或者危害较小。口服NADL-2毒株无毒性,但直接注入到子宫内会导致胎儿死亡[16]。目前,PPV如何通过胎盘屏障的机制尚不清楚,初步分析可能是巨噬细胞穿过猪上皮绒毛膜后经胎盘感染胎儿。

3 PPV疫苗

3.1 PPV灭活疫苗

2010年至今我国共批准6个PPV疫苗的新兽药注册申请,全部是灭活疫苗。PPV灭活疫苗是由非致病性PPV毒株经福尔马林、β-丙内酯和N-乙酰乙烯亚胺(N-acetyl ethylenimine,AEI)等进行灭活处理后,与佐剂乳化后制备而成。PPV灭活疫苗具有特异性抗体水平高、免疫效果好、容易保存和运输等优点,但病毒培养周期长、对生产场地和设备要求较高。用AEI灭活PPV L毒株病毒,终浓度为0.02%的AEI溶液、在30 ℃条件下灭活72 h为最佳条件[17]。对PPV L毒株经AEI灭活后制备疫苗的稳定性进行研究,疫苗在2～8℃环境中保存24个月,免疫豚鼠进行效力检测,血凝抑制(HI)效价不低于1∶64[18]。 PPV灭活疫苗虽然可诱导靶动物猪产生有效的抗体,预防母猪及仔猪免受同源或异源PPV的感染,但不能有效阻止或降低病毒的脱落,使猪群长期处于带毒状态。

3.2 PPV弱毒疫苗

用无致病力的PPV弱毒株或毒力致弱的强毒株制备的疫苗,弱毒疫苗具有免疫效力强、产生抗体快,但是不易保存、存在毒力返强等生物安全风险。临床上曾使用的PPV弱毒株为NADL-2株,该毒株是经54次传代后制备而成,该毒株注入猪体后,不会使母猪产生病毒血症,只有直接注射到母猪子宫中才会造成胎儿感染;不同的给药途径会影响病毒的增殖,直接肌肉注射,PPV会在母猪体内增殖,而口服NADL-2弱毒疫苗,不会出现病毒增殖的现象。弱毒疫苗曾经在PPV的防控中发挥重要作用,但近年来随着疫苗技术的发展逐渐被灭活疫苗取代。

3.3 PPV VLP疫苗

2016年至今,国内已有6个PPV VLP疫苗获得临床试验,VLP疫苗是由病毒的一种或多种衣壳蛋白自行组装的空衣壳,具有病毒粒子的形态结构,但是缺乏感染所需的核酸,可诱导高水平的体液免疫应答。通过引入伴侣蛋白Tf2,将Tf2与VP2在大肠埃希氏菌中共表达,正确折叠的VP2蛋白可形成VLP,可诱导小鼠和豚鼠产生特异性PPV的抗体,刺激IL-4、IFN-γ的分泌,并可有效降低豚鼠的带毒量,保护豚鼠免受PPV的感染[19]。大肠埃希氏菌蛋白表达系统蛋白表达量高、操作简单、生产成本低,是制备PPV亚单位疫苗的首要选择。

VLP的组装效率和稳定性对VLP疫苗的免疫效果影响巨大。用截短突变和定点突变对影响PPV VLP组装的关键氨基酸和中间体形态进行研究[20]。结果显示,VP2蛋白N端前47个氨基酸的缺失对VLP的组装没有影响,第48天冬酰胺(Asn,N)的缺失则使VP2蛋白丧失自组装能力。定点突变的结果发现,N47K降低了PPV VLP的组装效率,而N48K对PPV衣壳的稳定性、HA活性和自组装特性产生破坏性影响。蔗糖密度梯度离心的结果发现,关键氨基酸位点的缺失或突变会影响或破坏与PPV VLP组装密切相关的中间体的形成。Native PAGE的研究结果进一步表明,N48K不会影响VP2蛋白低聚物的形成,但是破坏了低聚物组装成大分子聚合物的能力。重组PPV VLP疫苗具有免疫保护效果好、生产成本低、生物安全性高等优势,成为PPV新型疫苗的研究热点。

3.4 核酸疫苗

核酸疫苗是将编码某种抗原的外源DNA或RNA直接接种到动物体内,依靠动物自身的表达系统对抗原进行表达并诱发特异性的免疫应答。用脂质体转染法将IBRS-2细胞中表达的PPV VP2免疫小鼠,14 d的小鼠血清中可检测到PPV特异性抗体,且未从小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑等组织DNA中扩增到VP2基因。用HEK293T细胞转染重组含有PCV的T细胞表位和PPV VP2基因的pcDNA3.1质粒,确定表达后以10 μg/只进行免疫,小鼠可产生针对PCV和PPV的特异性抗体,且促进了小鼠T淋巴细胞的增殖。随着新型冠状病毒肺炎mRNA疫苗的成功和和核酸疫苗递送技术的进步,动物用核酸疫苗的研究也逐渐成为热点。

4 PPV感染的防控

4.1 PPV检测

检测PPV抗原抗体的方法有病原学检测、血清学诊断和分子生物学诊断等[21]。当猪场内初产母猪出现多次发情、延迟分娩且伴随着木乃伊胎儿和产仔量减少时,需要及时开展PPV检测。分离提取病毒DNA检测PPV的早期感染,但操作复杂、易受病毒感染时间和毒力的干扰,临床上应用较少[22]。血清学诊断包括检测PPV抗体的血凝抑制试验(hemagglutination inhibition,HI)、病毒中和试验(virus neutralization test,VN)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA);检测抗原的血凝试验(hemagglutination,HA)、间接免疫荧光技术(indirect immunoinfluscent assay,IFA)等[23]。其中,HA和IFA是实验室最常用的检测PPV方法,首先用HA对PPV进行初步检测,其次应用IFA确定病毒的感染。HI、VN和ELISA等可用于血清样品中PPV抗体的检测。HI是基层兽医人员检测PPV抗体最经典的方法,但无法区分免疫猪群和PPV野毒株感染的猪群;ELISA是最常用的检测血清样品中PPV抗体的方法,灵敏度高,同时可区分灭活疫苗免疫猪群和PPV野毒株感染的猪群[24];VN检测需要进行细胞培养,相对繁琐,常用于实验室研究。分子生物学诊断包括常规的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测、核酸探针技术、单克隆抗体技术等。通过分析PPV的序列,找到其保守区域后设计引物,建立稳定的、灵敏的PCR、实时荧光定量(real-time PCR)检测方法。

4.2 生物安全

猪场应坚持自繁自养的原则,需要引进种猪时,应从具有《种畜禽生产经营许可证》的种猪场引进。种猪到场后,隔离饲养40～60 d,按既定程序进行免疫接种,确定无疫病后方可混群饲养。重视猪的饲养环境管理工作,对猪的饮食环境定期消毒, 防止病原微生物流行。尽量避免外来人员及车辆进入场区,需要进入的外部车辆和人员应严格遵守消毒管理规则,清洗消毒后方可进入。饲养人员实行封闭管理模式,不接触或食用外部新鲜猪肉及猪肉制品。

5 小结与展望

猪细小病毒主要引起繁殖障碍,是危害养猪业生产的一大难题。猪细小病毒病没有特效的治疗措施,只能靠疫苗接种来防控。因此,要重视日常管理,适时接种疫苗,发现病例要及时隔离消毒,切断病毒传播途径。随着分子生物学技术和基因工程技术的不断发展,PPV新型疫苗研制已经取得了很大进展,将来必将研制出安全、高效、廉价的新型基因工程疫苗。