猪伪狂犬病疫苗研究概况

李雅雯,张 莉,丁向彬,鄢明华*

(1.天津农学院动物科学与动物医学学院,天津 300384;2.天津市农业科学院畜牧兽医研究所,天津 300381;3.国家动物疫病天津观测实验点,天津 300381;4.天津市畜禽健康养殖技术工程中心,天津 300381)

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是一种人畜共患传染病的重要病原,可感染猪及多种家畜和野生动物[1]。猪感染该病毒以后,临床表现以母猪怀孕中期流产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍,哺乳仔猪出现神经症状和高死亡率等特征。PRV的传染性强,发病后常常给猪群造成较为严重的经济损失,我国将其列为三类动物疫病[2]。1948年我国第一次报道猪伪狂犬病,随后该病在我国大部分地区呈地方性流行。20世纪90年代我国引进Bartha-K61基因缺失疫苗并大规模推广应用后,猪伪狂犬病得到了较好的控制。但在2011年后由于PRV流行毒株的变异使我国再次大暴发,给养猪业造成了巨大经济损失[3]。当前我国猪伪狂犬病的主要防控方法仍是疫苗免疫接种,关于猪伪狂犬病变异株疫苗的研究受到广泛关注,本文对PRV疫苗的种类和当前研究现状等方面进行了综述。

1 PRV的基因结构特征

PRV是一种由病毒核心、衣壳、被膜和囊膜组成的双链线DNA病毒[4],属于疱疹病毒科水痘病毒属。PRV的基因组由长独特短区(UL)、短独特区(US)、US两侧末端反向重复序列TRS和内部重复序列IRS组成,并包含了约70多个开放阅读框编码的多种蛋白[4]。gE、gI、TK是PRV的主要毒力基因, gB、gC、gD是其主要保护性抗原蛋白。研究表明, PRV编码基因中有一多半是病毒复制非必需基因,可通过缺失多个或部分非必需基因来降低病毒毒力,同时又能插入外源基因形成重组病毒,因此PRV被认为是一种理想的活病毒载体[5]。

2 PRV疫苗研究

2.1 灭活疫苗

20世纪90年代初分离筛选到PRV鄂A株,但由于该株疫苗的抗原是用 PRV全病毒,无法通过抗体检测来辨别免疫动物和受野毒感染的动物,因此在市场应用中受到较大的限制。直到2012年田克恭团队筛选出1株PRV变异毒株HN1201株,利用同源重组技术构建的gE基因缺失疫苗株((HN1201-ΔgE株),可有效地预防由流行株引起的PRV感染,该缺失株可诱导产生中和抗体水平较高,能有效地延缓或阻止gE抗体转为阳性阻止排毒,有利于预防和控制当前猪群中流行的猪伪狂犬病[6]。2019年和2021年我国分别批准了HN1201-ΔgE株和HNX-12株疫苗上市。

PRV灭活疫苗是将培养的PRV进行灭活并加入佐剂乳化制备。其优点是安全性好,接种后不会出现排毒现象,但接种灭活疫苗的免疫抗体持续期较短,通常需要多次接种才能取得较好的免疫效果[7]。由于多次免疫一方面会对动物机体产生更大的应激反应,另一方面会成倍增加工人的劳动强度和生产成本,导致此类疫苗在实际生产中推广应用受到较大的限制。

2.2 亚单位疫苗

亚单位疫苗是由PRV的保护性抗原基因在原核或真核细胞中的表达产物制成的疫苗。gB、gC、gD等糖蛋白可以诱导机体产生的中和抗体在没有补体的作用下在动物机体内均能抑制PRV,因此gB、gC、gD等糖蛋白成为研制PRV亚单位的首选蛋白[8]。20世纪90年代左右分别有不同团队研发出诱导机体表达中和抗体的亚单位疫苗[8],并可预防 PRV所致的母猪流产及仔猪死亡。通过对优化PRV gD胞外区密码子构建pCAGGS-PRV-gD真核表达载体并纯化重组蛋白,被重组蛋白3次免疫的小鼠机体中产生较高水平的抗体[9],为后续研发PRV亚单位疫苗奠下基础。有研究用PRV SA强毒株扩增出的gB基因与pET-28a载体相连构建表达质粒,抗原与不同佐剂配比制备的亚单位疫苗,证明gB/0il疫苗免疫保护率可达60%[10]。因亚单位疫苗只表达PRV的部分免疫原蛋白,整个过程不需要接触活病毒,不会有潜在散毒风险,有安全性更好、抗原纯度更高、稳定性更好以及容易和野毒进行鉴别等特点,在猪伪狂犬病的免疫和净化中具有良好的应用前景。但由于此类疫苗需要更高的抗原含量才能诱导机体产生足够的免疫保护,在实际应用中生产成本较高,目前均处于研究阶段,尚无商品化的疫苗获批上市销售。

2.3 弱毒疫苗

2.3.1 自然弱毒疫苗 在20世纪60年代国外学者就对PRV弱毒疫苗进行了研究,采取不同的方法制备PRV弱毒株疫苗,这些毒株共同点是通过gE基因的全部或部分缺失来达到使疫苗株毒力减弱的目的[7]。我国直到20世纪90年代从匈牙利引进自然弱毒株Bartha-K61疫苗株并成功研制疫苗,该疫苗株通过缺失整个gE、部分gI基因和gC部分位点突变来使PRV的毒力降低[11],同时保留了病毒株的免疫原性,并且可通过gE的抗体检测鉴别PRV的野毒株感染和疫苗株免疫。该疫苗株在注射后第7天可产生抗体,注射后第5周抗体水平达到峰值并可持续2个月以上。但在2011年后随着PRV变异,Bartha-K61株疫苗不能提供完全的免疫保护,因此国内多个团队开始对PRV变异株展开研究。

2.3.2 基因工程疫苗 随着生物技术的发展,通过基因工程手段对PRV的某些毒力基因进行定向敲除从而得到毒力较低、免疫原性好且安全的PRV基因工程疫苗成为研究热点。目前已报道在我国上市的疫苗中有利用基因工程技术制备出的PRV弱毒疫苗,包括HB-98株、HB-2000株、SA215株等在临床上都具有较强的免疫原性和安全性。除此之外,我国很多学者利用同源重组技术、细菌人工染色体技术(BAC)、Cre/lox P位点特异性重组技术和CRISPR/Cas9等基因编辑技术对PRV的变异株进行研究。

2.3.2.1 基因同源重组技术 基因同源重组技术是指在同源基因序列中DNA分子间或分子内进行重新组合[12]。20世纪末就有学者利用同源重组技术将PRV Fa株进行基因敲除,构建了PRV TK单基因缺失株,被免疫后小鼠可抵抗Fa株强毒的攻击。2011年后因为PRV变异,有研究分别利用同源重组技术构建了不同PRV变异株的基因缺失株,分别接种到易感动物体内,都具有较好的免疫原性和安全性[13]。用PRV变异株(QYY2012株)扩增US3基因作为同源臂构建了含EGFP的重组转移载体,转移载体和 PRVΔTK/gE株基因组共转染239T细胞,经Cre酶去除EGFP后构建的PRVΔTK/gE/US3缺失株具有良好的免疫原性,能作为优秀的PRV基因工程疫苗侯选毒株[14]。随着同源重组技术现发展逐渐成熟也更加稳定,但是病毒重组效率低,重组病毒纯化过程比较繁琐等不足,近年来在人类和动物疫苗的研究中应用逐渐减少,呈现被基因编辑等新技术取代的趋势。

2.3.2.2 细菌人工染色体技术 细菌人工染色技术是将PRV的基因组插入到BAC载体中,同时借助人工染色体对基因组进行保存和修饰[13]。PRV在机体内病毒复制比较慢,利用基因同源重组的方法构建重组病毒的过程比较复杂,而且纯化的过程也很耗时。而在大肠埃希氏菌中PRV的克隆能以单拷贝数或极低拷贝数的质粒进行复制,这种方法不易发生变异、效率高且更加准确,可成功制备出重组病毒。有研究分别利用该技术构建了强毒分离株PRV-ZJ株和重组病毒rvPRVBAC株[13]。利用细菌人工染色技术构建了HN1201TK-/gE-/gI-株,该毒株接种易感动物体后具有良好的免疫原性和安全性。用酶切技术对PRV基因组进行线性表达转染细胞后,发现该病毒生长特性与野毒基本一致且能稳定遗传[15]。在构建PRVAH02LA株BAC时,用 gE和gI基因位点取代成mini-F基因,成功获得了PRV AH02LA BAC[16]。但是BAC的构建复杂周期长,大基因组在克隆过程中会出现断裂,有可能在病毒的基因组中出现细菌基因组的残留,影响疫苗的生物安全。

2.3.2.3 Cre/lox P位点特异性重组系统 Cre/lox P位点特异性重组技术来自大肠埃希氏菌噬菌体P1中,其中包含了特异性Cre重组酶和loxP位点[17],该技术仅适合在特定的基因位点间进行特异性重组,该方法可有效地解决由随机整合引起的不确定因素,为建立一个稳定、高效的基因表达体系打下基础。利用Cre/lox P系统构建了含有单一lox P位点的TK单基因缺失株(rPRV2),结果表明插入loxP位点对病毒复制无显著影响,缺失TK基因后毒力大幅下降[18]。有研究首次利用该技术构建了gE单基因缺失株,再用相同的方法获得了PRV gE-/TK-株[19]。该双基因缺失株的半数致死量显著高于只缺失gE基因的毒株和野生毒株,且对小鼠有80%的免疫保护率。由此可见Cre/lox P系统能重复构建PRV多基因缺失株,为PRV基因缺失苗和载体疫苗快速检测或筛选提供了有效技术手段。

2.3.2.4 CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9基因编辑技术是通过入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中,并利用相应的CRISPR RNAs(crRNAs)将同源序列降解,为机体提供免疫能力。与传统的基因同源重组技术相比,它可以高效稳定的对基因组特定位点进行靶向修饰,提高修饰效率[20]。用CRISPR/Cas9及Cre/lox技术敲除PRV HNX病毒株的gE、TK基因,免疫保护试验表明双基因缺失株有较高的免疫保护能力,能抵抗亲本毒株的侵袭[21]。以PRV经典疫苗株Bartha-K61为骨架,通过该技术将gB基因替换为PRV变异株JS-2012的gB基因,获得重组病毒r PRV-BJB,发现重组毒株与疫苗株具有相似生长特性和蚀斑形态[22],能作为新型疫苗的备选株。利用该技术构建不同的PRV基因缺失株均具有较好的免疫保护能力,同时也为野生动物PRV基因工程疫苗的研制建立了一种高效的技术平台[23-24]。利用CRISPRE/Cas9基因编辑技术构建gE、gI、TK三基因缺失株,在免疫保护试验中三基因缺失株对亲本株PRV HeN1免疫保护率可达到100%,又成功构建能同时表达EGFP和Luciferase的双报告基因的重组病毒[25],可用于筛选sgRNA和抗病毒药物,证明了CRISPR/Cas9技术能成为治疗PRV的新型治疗手段[26]。利用CRISPRE/Cas9技术快速构建1株PRV单基因缺失株(PRV-1-ΔgE)[27],用CRISPRE/Cas9和Cre/lox P联合技术分别构建HNQYY2012ΔgE株[28]与rGXΔTK-/gE-/gI-株[29],被这两基因缺失株免疫的机体均能抵御亲本株入侵。用改造的偶联Cas9 D10A的pX335打靶载体,构建双sgRNA和Cas9蛋白共表达的单质粒打靶系统,并通过两质粒打靶系统构建出了PRV SX-10-2015-GM-CSF-eGFP-mCherry-ΔTK-ΔgI/gE重组病毒,该重组病毒具有较高的安全性且对小鼠具有100%免疫保护能力,能诱导小鼠机体产生更强的免疫应答能力,可作为疫苗的侯选毒株[4]。

3 总结

PRV疫苗在猪伪狂犬病的防控和净化中发挥了重要的作用。2011年以来,由于PRV流行株的突变,一些传统疫苗株对PRV变异株的攻击不能提供完全保护,导致PR在我国许多地区大规模流行。迄今,国内已有多个团队以PRV为骨架,应用基因工程方法成功构建了多种基因缺失的重组PRV毒株,为进一步研制PR疫苗奠定了基础。当前,研究开发针对PRV变异株的高效疫苗已经成为动保行业的研究热点,其中可用于PR免疫和净化的基因工程标记疫苗的研究尤为受到关注。由于基因编辑技术展示出免疫原性好且安全的特点,在动物病毒疫苗的研究中得到越来越广泛地应用,并有望在PRV标记疫苗和以PRV为骨架的多联多价疫苗的研究中取得更多的成果。