黄曲霉毒素诱发奶牛乳腺炎的潜在风险

翟长乐，陈 钰，王友信，袁正宁，穆兴伟，张西锋*

（1.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109；2.莱州市柞村畜牧兽医站，山东莱州 261429）

黄曲霉毒素是一类来自于霉菌中的剧毒物质，常见于霉变的玉米、花生、豆类、坚果类等粮油作物中，且污染范围还在不断扩大。在目前已知的二十多种天然黄曲霉毒素中，根据化学结构以及紫外线照射所发荧光的区别，可将黄曲霉毒素分为B1、B2、M1、M2、G1、G2 等多种亚型，而在此类衍生物之中，黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1)毒性最大，并被世卫组织归类为Ⅰ类致癌物[1]。AFB1 自发霉作物进入奶牛体内，严重影响了奶牛的生命健康和乳制品的食品健康安全。而乳腺炎作为一种奶牛常见的疾病，主要表现为乳腺组织炎症、红肿、疼痛等症状，诱发原因主要是细菌感染，但近年来，有研究表明饲料中的AFB1 也会对奶牛乳腺炎的诱发有一定作用[2]，本文主要综述AFB1 毒理作用，乳腺炎的致病机理及两者相关性研究进展，以期为预防和治疗奶牛乳腺炎疾病提供参考。

1 黄曲霉毒素的毒理作用

1.1 黄曲霉毒素的产生条件

黄曲霉毒素是黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一种双呋喃环类毒素，霉菌的产生条件宽泛、分布范围较广，当周围环境水分含量高于12%时即可在谷类作物、油料作物中大量生长繁殖，同时，大多数霉菌在室温条件下繁殖速度较快，且在25～32℃均可产毒，此外，大多数霉菌稳定性较强，极其耐热，不易清除[3]，尤以花生、玉米、棉籽等奶牛的饲料原材料污染最为严重，奶牛极易误食而被感染。

1.2 黄曲霉毒素B1 的危害

黄曲霉毒素B1 在许多物种中表现出肝毒性、肝癌、致突变和致畸作用。高剂量的AFB1 会导致动物发生急性中毒甚至死亡，临床表现为食欲不振、呕吐、体重减轻、便血、肝中毒及肝坏死等[4]。而低水平长时间的AFB1 摄入会导致机体慢性中毒，动物的生长受到影响，临床症状有肝硬化、骨骼畸形、生长迟缓等，严重的会引起癌症。此外，AFB1 还会诱导机体肿瘤的产生与扩散，干扰机体细胞DNA、RNA 的合成与代谢，导致肿瘤坏死因子α 的mRNA 表达水平升高，从而破坏蛋白质、脂肪的合成与分泌，影响线粒体以及溶酶体的结构和功能。AFB1 羟化后会分泌到乳，危害犊牛，污染奶源，影响乳制品质量进而危害人类健康。

1.3 黄曲霉毒素B1 的免疫毒性

黄曲霉毒素B1 会极大影响动物免疫系统的正常运行，严重损伤免疫器官的结构，导致其功能降低。长时间的AFB1 暴露会使免疫器官中实质细胞及淋巴细胞的凋亡百分比及细胞内的核碎片数量大幅增加。同时，脾脏脾小体以及动脉周围淋巴鞘中空泡明显增多，红髓与白髓间界限模糊；胸腺皮质区网状细胞形态结构不清，髓质区毛细血管扩张充血；法氏囊髓质组织细胞排列松散，且淋巴滤泡间有纤维结缔组织增生[5]。AFB1对体液免疫和细胞免疫也会造成一定损害。长期摄入AFB1 导致机体血液中红细胞和白细胞数目显著减少，免疫球蛋白水平明显下降，补体活性受到破坏，引发体液免疫功能抑制。同时，树突状细胞的抗原递呈能力严重失调，抑制T 细胞的分裂增殖，T 细胞亚群（CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+) 的百分比也明显下降，影响机体的的细胞免疫功能[6-8]。

1.4 黄曲霉毒素B1 的生殖毒性

黄曲霉毒素B1 对动物的生殖系统也有一定的伤害，公小鼠摄入含有高水平AFB1 的饲料后，严重影响睾丸发育，睾丸间质细胞功能受损并且大量凋亡，诱导睾丸萎缩和结构紊乱，生精小管干瘪，生精细胞数量减少。同时，睾酮合成受损，影响精子发生，附睾尾中精子量显著减少，异常精子量显著增加，精子质量降低，雄激素水平下降，繁育能力降低[9,10]。母小鼠怀孕期间食用饲料后，采食量降低、产子数减少、弱子数增多，AFB1 通过阻断卵母细胞成熟的细胞周期进程，影响囊胚的形成，胚胎发育受损，造成胚胎畸变，严重时会引起母小鼠失配或流产，同时，卵母细胞过度自噬，干扰卵巢卵泡发育，卵母细胞透明带软化，颗粒细胞退行性变，导致排卵卵泡数量减少，甚至完全耗尽，从而严重损害雌性生殖健康[11,12]。

1.5 黄曲霉毒素B1 对肾、肝、肠的影响

黄曲霉毒素B1 会对肾、肝、肠造成不同程度的损害，导致机体的物质代谢、排泄机能紊乱。长期服用AFB1 导致肾脏细胞脂质过氧化、细胞膜受损，肾脏的抗氧化能力降低，血清中肝酶含量升高，造成肾脏氧化损伤，表现为肾小管上皮细胞变性坏死，近曲小管萎缩，基底膜增厚，肾小球发生透明变性或纤维化，肾脏功能衰竭[13]。动物肝脏内主要通过羟化、脱甲基、环氧化反应降解AFB1，肝脏的正常功能受到影响，肝细胞脂变、纤维结缔组织和胆管上皮大量增生，造成肝脏肿大、坏死甚至癌变，同时也会损伤血管，毛细血管通透性增高，肝脏被膜下出现较多出血点[14]。AFB1 侵入机体后，对肠道细胞也具有毒性作用，可能引发细胞损伤和炎症反应，损坏肠上皮的形态和组织完整性，抑制其紧密连接蛋白的表达，导致肠黏膜结构和功能的紊乱，同时降低肠道微生物群的多样性和丰富度，破坏肠道屏障功能，造成机体的肠道菌群紊乱[15]。

2 乳腺炎的诱发因素

2.1 生存环境

奶牛乳腺炎的发生与垫料材料、通风情况和圈舍温湿度密切相关。有研究表明，垫料中的锯末是导致克雷伯氏杆菌乳腺炎的风险因子，泥炭和秸秆也有诱发奶牛乳腺炎的可能[16]。场地宽松、环境清洁、通风良好，可降低病原微生物与奶牛直接接触的机会，减少感染的可能性。气温过高引起的热应激、夏季气温过低引发的热射病或养殖设备不完善导致的昼夜温差过大，均可导致机体免疫功能受损，增加患病的风险[17]。潮湿、脏乱的环境存在大量的蚊虫等生物传播媒介，加快病原体的繁殖与传播，对奶牛的健康造成极大的威胁[18]。

2.2 奶牛自身

奶牛的年龄是诱导乳腺炎发生的重要因素之一，据报道，乳腺炎多发生于8～12 岁奶牛，老年奶牛由于多年挤奶，乳头管变宽，加之身体素质和免疫功能降低，抵抗外界病原体入侵的能力逐渐减弱，细菌侵入乳腺的概率增加[19]。产犊次数较多的奶牛也是患乳腺炎的主要群体，产后乳房下垂、乳头呈漏斗形或乳区不活跃的奶牛，患亚临床乳腺炎风险较高[20]。遗传因素也会影响奶牛对乳腺炎的易感性，患乳腺炎的奶牛产下的后代往往具有较高的发病率，乳头管生理结构松弛的奶牛的乳腺炎发病率相对更高[21]。

2.3 饲养管理

饲养管理方式也是家畜乳腺炎的诱发原因。在人工挤奶时，部分挤奶员在挤奶前未对乳房进行充分按摩和热敷或挤奶速度过慢，导致放乳反射不强烈或放乳反射周期已过，乳房内有残留奶，易造成致病菌的繁殖[22]，在机械挤奶过程中，挤奶器指标调整不当、脉动器频率不稳定以及榨乳操作规程不规范都可能会诱发奶牛乳腺炎。此外，部分乳头在牛奶挤净后不能及时卸下挤奶器，持续抽挤导致乳房受到一定损伤[23]，使病原菌入侵乳腺几率增加。对于患有乳腺炎的奶牛，若未能及时隔离、治疗或淘汰，将导致病原体在牛群中传播，给健康牛的生命健康造成严重威胁。

2.4 饲料安全

黄曲霉毒素广泛存在于奶牛的饲料作物中，尤其当外界环境潮湿及闷热时，饲料的污染更加严重[24]。有研究表明，当使用配合饲料饲喂奶牛时，尤其是当配合饲料中玉米含量较高时黄曲霉毒素的感染量或许有增加的趋势，相应牛奶检测出的黄曲霉毒素的几率增加[25]。饲料粒径偏离标准也会增加黄曲霉毒素残留的可能性，粒径偏小会大幅缩短瘤胃分解毒素的时间，使得毒素残留体内的可能性提高[26]。此外，饲料的营养水平低下、微量元素供应不足以及突然改变饲料成分会使得奶牛体内的防御屏障功能不全，导致免疫力下降，乳腺炎易发。同时，近年来，为提高奶牛产奶量，饲养者往往大幅提高饲料蛋白质的比例，这种状况往往增加了奶牛乳腺的负担，提高了乳腺炎的发生率[27,28]。

3 乳腺炎致病机理

3.1 环境致病菌的致病机理

3.1.1 金黄色葡萄球菌的致病机理

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的最常见细菌之一，感染的乳腺炎类型一般为隐性或慢性感染，引起的症状通常不严重，甚至没有症状，但感染持续性强，容易复发，通常于挤奶期间在奶牛内部及奶牛之间传播。

金黄色葡萄球菌可以黏附在不锈钢、聚苯乙烯和橡胶等材料表面，定植形成生物膜，广泛存在于地板、挤奶装置等奶牛生存环境中，生物膜稳定性极强，难以去除，导致菌体持续存在，侵入机体后，生物膜的存在极大增强了菌体对机体免疫反应的抵抗力以及对于抗生素和杀菌剂的耐受能力，造成机体的长期感染。菌体在牛乳腺上皮细胞的F-肌动蛋白微丝聚合的过程中侵入细胞，逃避机体的免疫损伤，并且在牛乳腺上皮细胞中进行自我复制，造成细胞损伤[29]。此外，金黄色葡萄球菌还会分泌多种细胞外毒素，包括溶血素、肠毒素以及杀白细胞素等，溶血素会直接攻击乳腺上皮细胞膜，导致血小板损伤、溶酶体破坏、缺血和坏死，肠毒素通过引发细胞因子风暴对宿主产生间接影响，而杀白细胞素会特异性攻击免疫细胞，这些物质在诱导乳腺炎发生方面发挥了重要作用[30]。脂磷壁酸（Lipteichoic acid，LTA) 是金黄色葡萄球菌细胞壁中的重要成分，LTA 侵入乳腺上皮细胞后，可强烈诱导趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL3 和及CXCL8 的分泌，募集大量中性粒细胞进入乳腺，但诱导产生的促炎细胞因子（TNF-α、IL-1 β、IFN-γ) 十分有限，机体只能发生有限的免疫应答反应，造成了金黄色葡萄球菌的长期感染[31]。自噬作为一种有助于细胞内病原体降解的宿主防御机制，可识别和捕获侵入细胞的细菌并最终靶向溶酶体。金黄色葡萄球菌感染后，乳腺上皮细胞和巨噬细胞的自噬作用被激活，自噬体的形成增加，但金黄色葡萄球菌的存在导致自噬体和溶酶体的融合受到抑制，阻碍了自噬体的成熟与降解，自噬通量受阻，自噬体的积累促进了金黄色葡萄球菌在细胞中的存活和复制[32-34]。

3.1.2 无乳链球菌的致病机理

无乳链球菌也是诱导奶牛乳腺炎的重要致病菌之一，属于专性乳腺寄生菌，其可以附着、破坏乳腺管壁从而引起隐性感染的乳腺炎。同时，无乳链球菌具有高度传染性，一旦牛群中有感染病例，传播迅速，致病率高。

无乳链球菌的毒力因子具有附着和侵袭机体细胞的作用，菌体表面的黏附因子可与细胞表面外基质蛋白相互作用黏附于乳腺上皮细胞上，随后，细菌的Alp 蛋白可由脂筏介导侵袭进入细胞中[35]，此外，有研究表明，细菌的荚膜多糖有助于菌体生物膜的形成，生物膜可防止机体免疫细胞补体介导的吞噬作用，为无乳链球菌在机体内存活和繁殖提供了条件[36]。同时，菌体毒力基因中lmb 基因的表达产物层粘连蛋白结合蛋白，可以协助参与细菌的粘附作用，scpB 基因编码产生的C5a 肽酶，可以导致中性粒细胞募集通路受损并结合纤连蛋白以促进细菌侵袭上皮细胞，BCA基因编码α 蛋白帮助细菌进入乳腺上皮细胞，引起感染[37]。在菌体侵入乳腺上皮细胞后，会促使糖酵解过程中催化果糖-1,6-二磷酸转化为果糖-6-磷酸的磷酸果糖激酶以及氧化3-磷酸甘油醛转化为1,3-二磷酸甘油醛的甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达量下调，ATP 合成量减少，乳腺上皮细胞的代谢受到明显抑制，从而显著影响细胞增殖、乳蛋白和乳糖合成以及产奶量[38]。另有研究表明，分离自临床型乳腺炎的无乳链球菌分离株SAGFX17 在感染量较少时会刺激机体中性粒细胞的增殖分化，并诱导中性粒细胞胞外诱捕网的形成，引发机体较好的免疫应答作用。当感染量继续增加到一定程度时，中性粒细胞的功能会受到抑制，显著提高了无乳链球菌在中性粒细胞内的存活率，促使无乳链球菌在乳腺中定植[39]。

3.1.3 大肠杆菌的致病机理

大肠杆菌广泛存在于自然环境中，在正常情况下不会引起人和动物感染，但当机体免疫力低下时会导致疾病，造成奶牛的急性乳腺炎，通常恢复较快，但特定菌株也会引起持续感染，在极端情况下，大肠杆菌乳腺炎也可诱发严重的全身性临床症状，如脓毒症等。

造成急性乳腺炎和持续性乳腺炎的两种大肠杆菌菌株都会诱导牛乳腺上皮细胞中促炎细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、趋化因子CCL20、CXCL2、MHC I 类分子以及细胞凋亡相关基因caspase-3 等表达量上调，且急性菌株的上调幅度明显高于持续性菌株，以致急性菌株感染的乳腺炎诱导的机体免疫反应较强，大部分可以被宿主的免疫系统清除，而慢性菌株只能引起机体免疫应答基因的中度表达，使得大肠杆菌菌株在乳腺内大量增殖和持续性存在，从而导致机体的长期感染[40]。脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS) 是大肠杆菌细胞壁的重要组成部分，有研究表明，LPS 会与乳腺上皮细胞表面toll 样受体-4 结合，激活其下游的信号通路，诱导细胞中核因子NF-κB 活化，促进乳腺中促炎细胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表达[41]。乳腺上皮细胞中紧密连接蛋白Claudins结构组成也会发生改变，血乳屏障破坏，提高了大肠杆菌侵入乳腺的可能性[42]。随后，侵入机体的大肠杆菌菌株通过网格蛋白介导的内吞作用进入乳腺上皮细胞，避免机体内体酸化和内体-溶酶体融合等免疫防御机制，增加了菌株在机体内存活的机会，为大肠杆菌在乳腺环境中快速的生长和繁殖提供了条件[40]。大肠杆菌通过下调牛乳腺上皮细胞的线粒体膜电位（Mitochondrial mem-brane potential，MMP)，导致线粒体膜通透性转换孔MPTP 持续开放，促使线粒体中的细胞色素氧化酶Cyt-C 等促凋亡因子释放入胞质，启动内源性细胞凋亡途径，激活caspase-3 从而诱导牛乳腺上皮细胞凋亡，造成奶牛乳腺炎[43]。乳腺中脂肪代谢基因的表达也会由于大肠杆菌感染而降低，牛奶中脂肪分泌的总量减少，同时影响牛奶中的脂肪百分比，使得患有大肠杆菌乳腺炎的奶牛产奶量及产奶质量显著下降[44]。

3.2 霉菌毒素的致病机理

3.2.1 黄曲霉毒素B1 通过导致小鼠肠道菌群紊乱诱导乳腺炎发生

当奶牛机体感染乳腺炎时，中性粒细胞趋化因子会迅速募集原本存在于血液中的中性粒细胞通过基底膜和乳腺上皮迁移至乳腺，使乳汁中出现大量的中性粒细胞，中性粒细胞可杀灭大量病原菌，并且霉菌毒素造成的炎性反应越严重，奶牛乳腺中存在的中性粒细胞相应就越多，因此常把中性粒细胞认为是乳腺炎的主要诊断指标。肠道菌群在维持机体屏障的完整性、保证内环境稳定和增强免疫功能方面具有重要作用。有研究表明，在使用AFB1 灌胃实验小鼠后，菌群的组成成分及丰度降低，有益菌含量明显降低，有害菌含量显著增高，严重破坏肠道菌群的内环境稳态[45]。肠道微生物群的改变会使得肠道的粘膜屏障和上皮屏障发生破坏，系统性炎症增加。有研究发现，肠道菌群的丰度和乳腺炎的发生有极强的关联性，乳腺炎奶牛和健康奶牛相比，肠道菌群的组成结构发生明显变化，颤螺菌属（Oscillospira)和瘤胃菌属（Ruminococcaceae) 相对丰度普遍增加，粪厌氧棒杆菌属（Anaerostipes)、乳杆菌属（Lachnospiraceae) 和罗氏菌属（Roseburia) 相对丰度明显减少[46]。将乳腺炎奶牛的粪便菌群移植给无菌小鼠后，小鼠出现乳腺炎症状，并伴随血清、脾脏、结肠等部位的炎症发生[47]。同时，肠道菌群组成改变会下调ZO-1、Occludin 和Claudin-3 等乳腺上皮细胞间的紧密连接蛋白的表达，血乳屏障通透性显著增高，改变中性粒细胞穿过血乳屏障的阈值，导致大量中性粒细胞募集至乳腺并加重乳腺炎[48]。

3.2.2 黄曲霉毒素B1 通过破坏血乳屏障诱导乳腺炎发生

血乳屏障在中性粒细胞从血液转移到乳汁中起着重要作用。血乳屏障通透性的增加会导致乳腺中出现大量中性粒细胞，加重奶牛的乳腺炎，血乳屏障的功能主要依赖于乳腺上皮细胞的完整性以及细胞间的连接作用。有研究表明，乳腺中的乳腺上皮细胞是AFB1 羟化为AFM1 及其他代谢产物的主要场所，随着奶牛摄入AFB1 浓度的增加，乳腺上皮细胞的损伤程度也随之加重。AFB1 长期感染会导致乳腺上皮细胞内的活性氧升高以及MMP 部分丢失，同时抑制机体抗氧化物过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶的表达量，造成乳腺上皮细胞的氧化应激，上调细胞凋亡蛋白caspase-3 的表达，诱导细胞凋亡[49,50]。有研究表明，AFB1 也可以通过促进髓细胞白血病因子1（MLF1)、细胞周期调节因子家族成员A（SPDYA) 以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1C（CDKN1C) 的表达，导致细胞周期S 期缩短以及G1 和G2 期停滞，同时，AFB1 会下调生长停滞特异性基因2（GAS2)、高迁移率族AT-hook2（HMGA2) 以及血小板反应素-1(THBS-1)的表达，抑制细胞骨架和微管的形成，导致DNA 转录过程受阻，抑制乳腺上皮细胞增殖，细胞活力降低。此外，AFB1 可以编码G 蛋白偶联受体（GPR37L1)、溶质载体家族40成员1（SLC40A1) 等在细胞凋亡过程中发挥作用的基因的表达，最终造成细胞凋亡[51]。STAT5A 基因的表达会诱导乳腺上皮细胞增殖分化，有研究表明，STAT5A 基因的表达被AFB1以剂量依赖的方式显著下调，导致乳腺上皮细胞的DNA 损伤，影响了乳腺上皮细胞之间的间隙连接作用[52]，同时，日粮中添加AFB1 会导致乳畜体内的体细胞数（Somatic Cell Count，SCC)大量增加，也可能破坏细胞间的紧密连接，导致大量促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α涌入乳腺，进一步增加血乳屏障的通透性，导致牛奶中的SCC 含量增高[53]。此外，AFB1 引起的乳腺上皮细胞中p-p65、p-IκB-α 蛋白的上调表达，也会促进炎症相关因子TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β 的分泌，激活NF-κ B 信号通路，引起炎症反应的发生，趋化中性粒细胞迁移进入乳腺，诱发乳腺炎[54]。

4 小结

目前，随着人民生活水平的提高，如何提高乳制品质量及其产量日渐成为我国泌乳研究的重点。由环境致病菌导致奶牛乳腺炎的机制研究已相对成熟，但对于AFB1 诱导乳腺炎的机制研究较少，致病机理尚未明确。因此，通过探究AFB1 诱发奶牛乳腺炎的潜在风险，将为寻找预防和治疗靶点提供新的理论依据。