紫草油搽剂的制备工艺及质量评价

吴 韵 吴 俊 何 频 洪仕奎 马丽娟 夏开梅 成 雪

湿疹是临床上常见的一种反复发作的皮肤炎症变态反应，表现为皮肤瘙痒、疼痛[1-2]。因年轻父母缺乏养育经验，以及非植物纤维尿布的使用，湿疹、尿布疹的发病率逐年升高，可对新生儿生命健康造成严重影响。紫草油出自清代《疮疡大全》，对小儿湿疹、尿布疹治疗效果明显，而紫草油搽剂是在紫草油方的基础上总结出的经验方，由紫草、金银花、地黄、当归、防风和冰片组成，具有清热解毒、凉血止痛、燥湿止痒的功效，用于新生儿湿疹、尿布疹。目前，临床上使用的紫草油搽剂是由医生为患儿开具紫草油处方，由患儿家长自行加入菜籽油浸泡处方，得到的自制紫草油搽剂存在质量不稳定、疗效不确切等问题。本研究对紫草油搽剂制备工艺进行了优化，并初步评价其质量，为进一步研究紫草的中药制剂提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

754PC紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），BCD-196SRX冰箱（合肥美的荣事达电冰箱有限公司），HH-W600数显三用恒温水浴锅（江苏金怡科技仪器有限公司），WFH-203B三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司），CQ-120超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂），FA1004电子天平（上海方瑞仪器有限公司）。

1.2 材料

95%乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200217），三氯甲烷（西陇科技股份有限公司，批号：191005），氢氧化钠（重庆川东化工有限公司，批号：20180101），盐酸（广东汕头市西陇化工，批号：20190806），紫草（湖北润康药姑山中药饮片有限公司，批号：20220401），金银花（湖北润康药姑山中药饮片有限公司，批号：210701331），生地（贵州同济堂中药饮片有限公司，批号：220401），防风（湖北润康药姑山中药饮片有限公司，批号：220701），当归（重庆上药慧远庆龙药业有限公司，批号：220600121），冰片（福建青松股份有限公司，批号：220307），左旋紫草素（中国药品生物制品检定所，批号：110769-200506），地黄对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：121180-202107），山茶油（湘西沃康油业科技有限公司，批号：WK0520），环己烷（西陇科技股份有限公司，批号：20210709），乙酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司，批号：20220412），甲醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200318），甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20190803），冰乙酸（罗恩试剂，批号：RH197316），甲苯（国药集团化学试剂有限公司，批号：20230105）。

2 方法与结果

2.1 单因素试验

对浸泡时间、药材粉碎度、提取次数、超声促溶时间进行单因素考察。固定其他因素不变，每次改变1种因素，即称取处方量药材，用山茶油浸泡，滤过，合并滤液。取3 ml于分液漏斗中，加入1%氢氧化钠溶液萃取3次，20 ml/次。在萃取液中滴入10%盐酸溶液直至其变为粉红色，将其转入到分液漏斗中，用三氯甲烷进行萃取，萃取3次，所用体积分别为20 ml、20 ml、10 ml。将萃取得到的溶液挥干后用95%乙醇复溶至50 ml容量瓶中，定容至刻度，即得。结果表明超声促溶时间对样品中羟基萘醌总色素的含量影响较小，而浸泡时间3、4、5 d，药材为原药材、粗碎品、细碎品，提取次数1、2、3次时，对羟基萘醌总色素的含量影响较大。

2.2 正交试验

2.2.1正交试验因素水平根据单因素考察结果，以影响制备工艺的三大主要因素提取次数（A）、药材粉碎度（B）、浸泡时间（C）为考察因素，以羟基萘醌总色素为指标，用L9（34）正交试验优选紫草油搽剂的最佳制备工艺，因素水平见表1。

表1 正交因素水平

2.2.2正交安排及结果根据因素水平表，按照L9（34）正交设计表进行实验。羟基萘醌总色素样品溶液制备为称取处方量药材，根据正交试验表1进行浸泡后，滤过。取3 ml于分液漏斗中，加入1%氢氧化钠溶液萃取3次，20 ml/次。在萃取液中滴入10%盐酸溶液直至其变为粉红色，将其转入到分液漏斗中，用三氯甲烷进行萃取，萃取3次，所用体积分别为20 ml、20 ml、10 ml。将萃取得到的溶液挥干后用95%乙醇复溶至25 ml容量瓶中，定容至刻度，即得。采用评分的方法，对实验结果进行分析。见表2。

表2 正交试验评分

K1、K2、K3分别代表提取次数、药材粉碎度及浸泡时间3个水平下的指标总和，数值越大，影响越大；R代表极差，表明提取次数、药材粉碎度及浸泡时间对整个工艺的影响，数值越大，影响越大

2.2.3数据处理由极差R可知，对紫草油搽剂制备工艺影响最大的是浸泡时间（C），其次是药材粉碎度（B）和提取次数（A）。采用SPSS 26.0对两组平行数据组间误差进行方差估算，结果表明，因素A、B、C对实验结果均有显著性影响。见表3。因素C3＞C2＞C1，B1=B2＞B3，A2＞A1＞A3，因此紫草油搽剂制备的最佳工艺为225 ml山茶油浸泡原药材，浸泡两次，共浸泡5 d。

表3 正交试验数据方差分析

2.3 验证试验

称取处方量药材，根据正交试验结果，进行3份平行试验。按照正交试验优选出的最佳制备工艺，即加入山茶油浸泡原药材，每次225 ml浸泡2.5 d，浸泡两次，共浸泡5 d。按照“2.2.2正交安排及结果”项下处理样品，结果表明该工艺稳定可行，重复性较好。见表4。

表4 正交优选验证性试验结果

2.4 质量评价

2.4.1外观性状紫草油搽剂为紫红色透明油状液体。

2.4.2含量测定

2.4.2.1对照品溶液制备精密称取左旋紫草素对照品0.001 1 g于10 ml容量瓶中，加入95%乙醇定容至刻度，超声使左旋紫草素完全溶解，即得。

2.4.2.2供试品溶液制备称取处方量药材，放入带塞的玻璃瓶中，加入225 ml的山茶油浸泡2.5 d，滤过，再加入225 ml的山茶油浸泡2.5 d，过滤，合并滤液。取滤液3 ml于分液漏斗中，加入1%氢氧化钠溶液萃取3次，20 ml/次。在萃取液中滴入10%盐酸溶液直至其变为粉红色，将其转入到分液漏斗中，用三氯甲烷进行萃取，萃取3次，所用体积分别为20 ml、20 ml、10 ml。将萃取得到的溶液挥干后用95%乙醇复溶至25 ml容量瓶中，定容至刻度，即得。

2.4.2.3最大吸收波长[3]精密量取对照品溶液、2.4.2.2项下制备的供试品溶液适量，以空白溶剂为对照，于200～800 nm波长下进行扫描，对照品与供试品溶液于522 nm处均有最大吸收，确定522 nm为本实验的测定波长。见图1～2。

图1 左旋紫草素对照品光谱波长

图2 供试品溶液光谱波长

2.4.2.4标准曲线的绘制精密配制不同浓度的左旋紫草素对照品溶液，分别为0.019、0.038、0.076、0.114、0.19 mg/ml，按2.4.2.3项下操作步骤测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，左旋紫草素质量浓度为横坐标，进行线性回归分析，得到左旋紫草素回归方程为Y=4.852 2x+0.048 5，R2=0.999，结果表明左旋紫草素对照品溶液在0.019～0.19 mg/ml的浓度范围内与吸光度值成良好的线性关系，标准曲线见图3。

图3 左旋紫草素标准曲线

2.4.2.5精密度试验精密量取左旋紫草素对照品适量，按2.4.2.3项下操作，于522 nm处连续6次测定其吸光度，其相对标准偏差（RSD）值为0.04%（n=6），表明本实验仪器精密度良好。

2.4.2.6稳定性试验称取处方量药材，按照2.4.2.2项下制备供试品溶液，按2.4.2.3项下操作，于522 nm处测定0、10、20、40、80、120 min的吸光度，其RSD值为2.19%（n=6），表明显色反应在120 min内稳定。

2.4.2.7 重复性试验称取处方量药材6份，按照2.4.2.2项下制备供试品溶液，按2.4.2.3项下操作，于522 nm 处测定样品的吸光度，其RSD值为0.96%（n=6），表明重复性良好。

2.4.2.8加样回收试验取已知含量的样品6份，按照2.4.2.2项下制备供试品溶液，分别加入对照品溶液，按2.4.2.3项下操作，于522 nm处测定样品的吸光度，计算平均回收率为99.98%，RSD为0.13%（n=6），表明该方法的准确性良好。

2.4.2.9样品测定称取处方量药材3份，按照2.4.2.2项下制备供试品溶液，按2.4.2.3项下操作，于522 nm处测定吸光度，将吸光度代入2.4.2.4项下的标准曲线中，结果得到紫草油搽剂中羟基萘醌总色素含量。见表5。

表5 3批紫草油搽剂的含量

2.4.3.1.4 显色剂制备取5 g氢氧化钾溶于50 ml甲醇溶液中，得到10%氢氧化钾甲醇溶液。

2.4.3.1.5 薄层方法依照2020版《中华人民共和国药典》[3]中TCL，分别吸取2.4.3.1.1、2.4.3.1.2、2.4.3.1.3溶液在同一硅胶G板上点样，用环己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1）混合液展开，自由挥干后，观察斑点，再喷以10%氢氧化钾甲醇溶液显色，观察斑点。

2.4.3.1.6 薄层结果紫草的TCL鉴别结果见图4，从图中可知，自由挥干后在相同位置出现紫红色的斑点，显色后在相同位置出现蓝色斑点。

图4 紫草的TCL鉴别

2.4.3.2地黄的TCL鉴别

2.4.3.2.1 对照品溶液的制备精密称定地黄对照药材1 g，加入20 ml石油醚静置24 h后，挥干溶液，用1 ml氯仿溶解，即得。

2.4.3薄层色谱法（TLC）鉴别

2.4.3.1 紫草的TLC鉴别

2.4.3.1.1 对照品溶液的制备精密称定左旋紫草素对照品，加入95%乙醇溶液得到浓度为0.36 mg/ml的对照品溶液。

2.4.3.1.2 样品溶液的制备按照2.4.2.2项下制备供试品溶液，取5 ml浓缩至1 ml。

2.4.3.1.3 阴性对照品溶液的制备按处方去掉紫草，按照2.4.2.2项下制备。

2.4.3.2.2 样品溶液的制备按照“2.4.2.2”项下制备供试品溶液，挥干后，用1 ml氯仿溶解，即得。

2.4.3.2.3 阴性对照品溶液的制备按处方去掉地黄，按照2.4.2.2项下制备，用1 ml氯仿溶解，即得。

2.4.3.2.4 薄层方法参考文献[4]，分别吸取2.4.3.2.1、2.4.3.2.3、2.4.3.2.3溶液在同一硅胶H板上点样，用环己烷-氯仿-冰醋酸（7∶2∶1）混合液展开，自由挥干后，观察斑点。

2.4.3.2.5薄层结果地黄的TCL鉴别结果见图5，由图5可知，自由挥干后在相同位置出现黄色斑点。

3 讨论

紫草作为一味常用的传统中药，拥有悠久的药用历史，一般在春、秋两季采收，其味甘、咸，性寒，主归心、肝二经，具有凉血活血、清热解毒、透疹消斑作用[5]。研究发现，紫草中的主要化学成分为醌类、黄酮类、生物碱类、酚酸类及多糖，以醌类为主，药理作用主要表现为抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等[6-7]，临床上常用于治疗溃疡、湿疹及烧烫伤等。羟基萘醌总色素是紫草中的主要有效成分，受热不稳定，因此本实验采用山茶油对紫草进行浸泡处理，有利于有效成分的溶出，成功制备紫草油搽剂解决了患儿家长自制药剂不安全、质量不稳定、疗效得不到保障等问题。

图5 地黄的TCL鉴别