基于网络药理学和分子对接分析古方四君子汤辅助治疗胃癌的作用机制*

陈小霞，陈国忠，谢彩杏，梁毅锋，郑日辉，杨昕

1 广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001； 2 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530001

目前，胃癌的发病率在消化道恶性肿瘤中居首位［1］。历代中医学家多认为，正气亏虚是肿瘤产生的先决条件，气虚不运导致气血湿痰毒之瘀滞，形成恶性肿瘤的主要病机，而脾胃为后天之本，气血生化之源，为正气生成的关键［2］。四君子汤通过补虚抗邪、固护人体后天之本，使机体保持气血阴阳平衡，提高胃癌患者免疫力，降低放化疗反应，同时促进癌细胞凋亡、抑制瘤体生长［3-4］。现代临床中，四君子汤常被用作基出方联合其他抗癌药物治疗消化系统在内的多种恶性肿瘤［5-6］。但是，应当认识到，胃癌是一种复杂的恶性肿瘤，而全面阐释四君子汤辅助治疗胃癌过程的机制仍然是医学界面临的难题［7］。新兴的网络药理学和分子对接将系统生物学和网络联结，与中医药整体观念、辨证论治原则基本一致，将为全面认识中医药在治疗胃癌过程的机制提供一定的参考依据［8］。

1 材料与方法

1.1 提取药物化学成分和靶点 在中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine system pharmacology，TCMSP）中选择“Herb name”，分别检索四君子汤中人参、白术、茯苓、甘草的化学成分，设定每个分子的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，综合考虑药理活性和机体利用度，并通过查询中国知网、PubMed数据库，补充四君子汤最新的活性成分和靶点，去重后进行编号。另外，在该数据库中查询四君子汤中各药物的靶点，运用Perl语言在UniProt数据库中将靶点名称进行基因名称转换。

1.2 提取胃癌靶点和计算药物-疾病共同靶点 以“gastric cancer”为关键词，在常用疾病数据库（GeneCards、OMIM和TTD）中检索胃癌靶点，排除重复项后进行汇总。并运用R语言计算药物-疾病共同靶点，绘制韦恩图。

1.3 构建药物-疾病调控网络并进行拓扑分析 用以Tab制表符分隔的文本文档和Microsoft Excel文件构建药物-疾病网络关系，对各节点进行个性化调整。并采用network analyzer插件进行网络特征分析，实行拓扑分析。

1.4 构建PPl网络 将已知的药物-疾病共同靶点输入STRING数据库，物种限制为人类（Homo sapiens），隐藏游离点，设定较高置信度（highest confidence）＞0.7，减少假阳性的发生并保证靶点的合理纳入，其他保持默认设置，保存tsv文件。然后导入Cytoscape中，利用network analyzer插件进行网络特征分析，突出PPI网络的关键靶点，最后用MCODE插件构建聚类功能模块。

1.5 GO和KEGG富集分析 将PPI网络的关键靶点导入Metascape数据库，限定物种为“Homo sapiens”，P≤0.01，得到GO富集分析的细胞生物过程和KEGG富集分析的结果，另外利用Cytoscape的插件ClueGo进行关键靶点和通路的关系分析。

1.6 分子对接验证 1）小分子化合物处理：选取“1.3”项中得到的排名靠前和结构各异的关键药物化学成分，通过PubChem下载其sdf格式，导入Chem 3D，分别保存为mol2结构文件，再导入Autodock Tools转存为pdbqt格式。2）大分子蛋白处理：在PubMed数据库中查询PPI排名前5的关键蛋白与胃癌相关的文献，选择研究较充分的前3个关键蛋白，通过PDB数据库，下载其pdb格式文件：要求人源蛋白优先；有蛋白与配体的复合物；最好蛋白的配体与AMD的结构类似。再导入Pymol中去除水分子、分离原始配体，在Autodock Tools中转存为pdbqt格式。3）最后设置活性口袋，利用Autodock Vina进行分子对接，保留结合能最低的一对进行分析展示。

2 结果

2.1 药物化学成分和靶点 在TCMSP数据库和中国知网、PubMed数据库中检索到药物化学成分136个，并取药物首拼对其进行编号，如人参：R01～R21，白术：B01～B07，茯苓：F01～F15，甘草：G01～G91。剔除1个人参和甘草的共同药物化学成分：RG001，最终得到135个药物化学成分，112个药物靶点。

2.2 胃癌靶点和药物-疾病共同靶点 在GeneCards数据库中筛选胃癌靶点，将相关性评分限制为≥9.81（中位数），同时在OMIM和TTD数据库进一步检索，取三者交集，得到胃癌靶点2847个，排除重复项后剩1423个。使用R语言计算药物-疾病共同靶点，得到65个。见图1。

图1 药物-疾病共同靶点韦恩图

2.3 药物-疾病调控网络和拓扑分析 将构建的网络和属性文件导入Cytoscape，绘制出由252个节点和1050条边构建成的网络图。使用network analyzer插件进行拓扑分析，计算并设定节点平均度值为4，平均介数中心性为0.000 548 96。另外根据两者值的大小在图中突出显示，筛选出关键的药物化学成分。见图2、表1。

表1 关键的药物化学成分

图2 药物-疾病调控网络

2.4 PPl网络 在STRING数据库中得到由65个节点，268条边构建的PPI网络。其中MAPK8、ESR1、CCND1、EGFR、IL-6、MYC、VEGFA、CASP3等为关键靶点。另外，在MCODE插件构建的聚类功能模块中，排名前三的MAPK8、ESR1、CCND1与其他靶点的连接程度评分均在2分以上，提示靶点功能团之间连接紧密，四君子汤治疗胃癌具有明显的多药效-多靶点作用关系。见图3。

图3 PPI网络

2.5 GO和KEGG富集分析 将在Metascape数据库得到的前20个细胞生物过程按计数值（Count）排序，其中每个节点代表一个富集的术语（term），相似度＞0.3的term通过边连接，汇聚成功能团，见图4。

图4 GO富集分析

另外，KEGG富集分析中，根据Count值筛选前20条通路进行可视化，见图5。关键靶点和通路的关系分析见图6。

图5 KEGG富集分析

图6 关键靶点和通路的关系分析

2.6 分子对接模型 Autodock Vina以结合能表示小分子与大分子化合物结合的程度。本次研究结合能均值为-7.64 kcal/mol＜-5 kcal/mol，说明小分子与大分子结合性好，且值越小表示构象越稳定，结合能由小到大，颜色由红至蓝排布，见图7。选取结合能最低的quercetin和MAPK8（PDB ID：4YR8）进行分子对接展示，MAPK8的氨基酸残基TYR-181和THR-325分别与quercetin以氢键相连接，提示前期分析所得的关键药物化学成分生物活性高，与核心靶点之间结合性好、构象稳定。见图8。

图7 结合能矩形热图

图8 quercetin与MAPK8的对接图

3 讨论

中医认为，脾胃运转一身之气，在人体正常的生命活动中起着重要的作用。而正气不足贯穿在恶性肿瘤的始终。四君子汤通过激发人体正气，补虚抗邪，调理脾胃以安五脏，在辅助治疗胃癌的中医药中，四君子汤始终发挥着重要作用［9］。

经检索发现，四君子汤共有135个药物化学成分，112个药物靶点，其中与胃癌的1423个靶点中共有65个交集靶点，充分体现了中药复方“多成分、多靶点”的特色，在构建的药物-疾病调控网络中明显展示了此种关系。其中，筛选得到四君子汤治疗胃癌关键的药物化学成分为槲皮素、异鼠李素、山柰酚等。槲皮素和山柰酚存在于多种传统中草药当中［10］，其中，槲皮素能诱导活性氧类的产生，增加胃癌细胞凋亡的细胞数，促进胃癌细胞凋亡，并改变相关基因的表达，阻断癌基因和信号因子的传导［11］。异鼠李素主要通过调节凋亡因子表达，下调Bcl-2，上调Bax，达到促进胃癌细胞凋亡的目的，并且能发挥阻断细胞周期相关蛋白的表达、抑制细胞增殖等作用［12］。山柰酚可对抗多种癌细胞转化，尤其在干扰胃癌细胞生长方面具有较大的作用。IMRAN等［13］认为，其通过抑制人胃癌细胞（MKN28和SGC7901）增殖活性和细胞自噬，将细胞周期阻滞于G2/M期，是促进胃癌细胞死亡的主要机制。KIM等［14］发现，山柰酚通过IRE1-JNK1途径介导Bcl-2-Beclin-1在胃癌细胞中的解离，从而诱导自噬细胞死亡，通过HDAC/G9a途径表观遗传介导自噬细胞死亡。另外，在PPI网络中，所得的关键靶点为MAPK8、ESR1、CCND1等。MAPK8也称为JNK1，属于JNK激酶家族，可直接结合并促进多种转录因子的磷酸化，参与信号传导。诸如促炎性细胞因子或细胞外刺激，通过激活SAP/JNK信号传导途径，能调节多种生物学过程，包括细胞分化、癌症进展及程序性细胞死亡，并通过不同的分子机制诱导癌症细胞的自噬［15］。ESR1可促进组装转录蛋白的复合物在染色质重塑，激活下游基因，达到调控胃癌的作用［16-17］。CCND1能抑制细胞周期蛋白表达，在G1/S过渡过程中阻断胃癌细胞的生长周期，减少癌细胞的不良分化［18］。早期发现，使用极光激酶B（aurora kinase B，AURKB）能触发丝氨酸磷酸化，影响细胞有丝分裂，诱导CCND1表达，促进胃癌发展，与胃癌患者的总体生存期有密切联系［19］。在分子对接中，四君子汤治疗胃癌关键的药物化学成分和靶点结合性好、构象稳定，较容易自发结合。另一方面，细胞生物过程多富集于RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、凋亡过程的负调控、DNA模板的转录正调控等途径，在KEGG通路中，四君子汤显著富集于p53信号通路、NF-κB信号通路、VEGF信号通路等与胃癌密切相关的癌症途径，这是临床经验和现代技术相互结合的结果［20-21］。

综上所述，本研究通过网络药理学结合分子对接技术，对四君子汤在胃癌中发挥的作用机制进行分析、验证，再结合已有文献论证方药的作用机理，基本实现对方剂多靶点、多通路的预测。在中医药理论指导下，将有望为临床应用四君子汤辅助治疗胃癌提供借鉴意义。