两个茶树品种维生素B6代谢通路的转录组分析

胡志宏

（百色市茶业发展中心，广西 百色 533000）

“凌云白毫茶”原名白毛茶，因其叶背长满白毫而得名，据考证有一千多年的生长历史，是全国第一批认定的国家级茶树良种之一[1]。《中国名茶志》记载：凌云白毛茶为历史名茶，创于清乾隆以前，原产于凌云县。“凌云白毫茶”因其叶背长满白毫而得名，主产于凌云县四季云雾缭绕的岑王老山、青龙山一带[2]。得天独厚的自然环境，使凌云白毫茶以色翠、毫多、香醇、味浓、耐泡五大特色成为中国名茶中的新秀[3]。“凌云白毫茶”叶芽肥壮，持嫩性好，加工后条索紧结微曲、白毫显露，香气馥郁持久、回味甘甜、板栗香型，而且适宜性强，目前已开发出绿、红、白、青、黄、黑等六大茶类，在国内外享有较高的声誉。

从1995年确定为优良单株，历经28年的努力，广西南亚热带农业科学研究所科研人员选育的“桂热2号”茶树新品种于2023年正式获得国家级优良品种登记[4]。“桂热2号”属乔木型大叶类，偏早芽，特显毫，树势强且适制绿茶、红茶及黄茶，适宜在广西地区栽培，现已在崇左市、百色市、柳州市等地推广[5]。“桂热2号”制作的绿茶条索紧结，外形肥壮，香气持久，有栗香，滋味鲜爽醇厚；制红茶，外形显毫，乌润、匀净、香气持久，滋味浓强、鲜爽。“桂热2号”所制茶产品曾7次在“中茶杯”“国饮杯”、中国黄茶斗茶大赛等全国性茶叶评比中荣获特等奖、一等奖、金奖，是极具推广潜力的广西本土茶叶品种。“桂热2号”茶树品种的优良特性将有利于其在广西茶区大面积推广，对广西茶园品种结构优化调整及茶产业的发展具有良好的促进作用，同时可新增广西茶产品的种类，提升产品品质与产量，促进茶企及茶农增收[6]。

维生素B6（vitamin B6，VB6）发现于20世纪30年代，属于B族的水溶性维生素，遇光或碱易被破坏且不耐高温[7]。VB6是生物体必需的微量营养物质，参与人体重要细胞代谢，同时具有抗氧化、抗病毒及抗炎等功能，对心脑血管疾病、糖尿病、癌症和神经性疾病等多种疾病治疗至关重要，在食品和制药行业中具有极高商业价值[8]。Chen CC等[9]研究发现，在PDXK或PLP水平上，维生素B6的药理学阻断明显有着抗白血病活性，维生素B6代谢通路在开发抗白血病的药物中有着重要的研究价值。张忆美[10]研究表明，对轻、重度脓毒症大鼠的6小时和12小时各组间的差异代谢物通过代谢途径分析，结果均与维生素B6代谢途径相关，进一步证明了维生素B6在预防脓毒症脑功能障碍中有一定的作用。

转录组分析在破译基因结构和功能，识别细胞、生理生化甚至生物系统基础的遗传网络以及应对生物和非生物胁迫方面发挥着至关重要的作用。目前，转录组测序技术在茶树功能基因探索[11]、制茶工艺[12]、品质及功效研究[13-14]等方面有着广泛的应用。目前，关于“凌云白毫茶”和“桂热2号”的转录组学研究报道较少，基于此，本研究以这两个茶树品种为试验材料，进行维生素B6代谢通路的转录组分析，探索“凌云白毫茶”和“桂热2号”在维生素B6上的差异，以期为二者的功能开发及深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集地点：广西百色市凌云县广西正道茶业有限公司茶园

采集时间：2023年7月

采集对象：“凌云白毫茶”茶树枝条上的一芽二叶，三个重复，样本编号为A；“桂热2号”为嫁接茶树（砧木为“凌云白毫茶”），同样为茶树枝条上的一芽二叶，三个重复，样本编号为B。

1.2 试验方法

通过对试验材料进行转录组测序，将获得的Clean Reads使用HISAT2[15]比对到参考基因组[16]以获取在参考基因组或基因上的位置信息和测序样本唯一的序列特征信息。然后对2个样本的FPKM值进行统计，用DEseq软件分析差异基因表达，将差异基因筛选后注释到KEGG数据库中，并重点分析维生素B6代谢KEGG通路和进行GSEA分析。

1.3 数据分析

数据统计分析Microsoft Excel 2019软件，转录组分析用R软件进行。

2 结果与分析

2.1 PCA分析

通过对样本的PCA分析（主成分分析），可以反映不同样本之间组成成分的差异。如图1所示，样本的第一主成分（PC1）为49.87%，第二主成分（PC2）为15%，第三主成分（PC3）为12.9%且两个样本在3D图中存在明显的空间距离，说明两个茶树品种的基因组成有着显著区别。

图1 各组样本基因的PCA得分图

2.2 差异基因KEGG通路富集分析

生物体内的不同基因产物通过相互作用行使生物学功能，对差异基因的通路注释分析有助于进一步解读基因的功能。在A与B的比较中，有2219个差异基因被注释到了138条通路中，这些通路主要包括类胡萝卜素生物合成、植物-病原相互作用、核黄素代谢、单萜生物合成、D-氨基酸代谢等途径（图2）。

图2 样本A和B差异基因KEGG富集图

2.3 维生素B6代谢KEGG通路分析

在进行KEGG富集分析之后，选取维生素B6代谢通路（ko00750）进一步分析，共有4个酶和6个差异基因参与此通路。其中，一个差异基因对应吡哆醛磷酸酶（EC:3.1.3.74），一个差异基因对应吡哆胺5'-磷酸氧化酶（EC:1.4.3.5），一个差异基因对应吡哆醛5'-磷酸合成酶pdxS亚基（EC:4.3.3.6），三个差异基因对应吡哆醇4-脱氢酶（EC:1.1.1.65），酶和基因的对应关系如表1所示，有2个上调基因，4个下调基因。图3为差异基因参与的维生素B6代谢通路可视化。

表1 与维生素B6代谢通路相关的基因

图3 维生素B6代谢通路的差异基因

2.4 维生素B6代谢KEGG通路GSEA分析

常规的基于超几何分布的富集分析依赖于显著上调或下调的基因，容易遗漏部分差异表达不显著但有重要生物学意义的基因。基因集富集分析（GSEA）[17]不需要指定明确的差异基因阈值，把基因按照在两组样本中的差异表达程度进行排序，然后采用统计学方法检验预先设定的基因集合是否在排序表的顶端或底端富集。GSEA分析可以有效解释某个通路中既有上调基因又有下调基因时该通路总体上是被抑制还是被激活的状态。

通过GSEA分析，发现维生素B6代谢KEGG通路的ES值（Enrichment Score富集得分值）为0.27，NES值（ES值标准化后的富集得分值）为1.16，NOM p-val值（p值，富集分析统计学显著水平）为0.22，FDR q-val值（对p值的校正）为0.44，FWER p-val值（总体错误率P值）为1。从维生素B6代谢通路的背景基因聚类热图（图4）中发现注释到该通路的基因有43个（CSA031162、CSA013361、CSA011221、CSA034509、novel.20473、CSA021653、CSA033984、CSA011806、CSA011222、CSA021654、CSA004703、CSA004704、CSA011807、CSA004138、CSA029833、CSA011805、CSA005035、CSA029934、CSA035444、CSA025321、CSA016678、CSA000602、CSA031802、Novel.19988、CSA006642、CSA030934、CSA005036、CSA028404、CSA005241、CSA 036155、Novel.6649、CSA031803、CSA022002、CSA022003、CSA031801、CSA028518、CSA016826、CSA034003、CSA035284、CSA011220、CSA007728、CSA017295、CSA020372），占总背景基因数18858个的0.23%。其中，CSA031162、CSA013361、CSA011221、CSA034509、novel.20473等五个基因为核心基因，在该通路中起到较大的作用，贡献较大（表2）。同时从GSEA富集分析结果图6中可以看出B在折线图中的折线和X坐标轴形成的面积相较于A更大。综上所述，A相比于B在维生素B6代谢KEGG通路中，整体上A受到了抑制，B得到了激活，B在该通路中更为活跃。

表2 维生素B6代谢通路的GSEA富集分析表y

图4 维生素B6代谢通路的背景基因聚类热图

图5 维生素B6代谢通路的GSEA富集分析结果图

3 讨论

维生素B6是一种低分子有机化合物，在促进动物健康生长发育和维持正常生理功能上发挥着重要作用。维生素B6可作为辅酶参与氨基酸、碳水化合物、脂类及核酸代谢等140多种生化反应。在临床研究中发现，维生素B6还具有调节氧化应激和炎症反应的作用。维生素B6缺乏与多种炎症性疾病的患病风险增加有着密切联系[18]。Mei M等[19]研究发现，肝细胞癌在VB6代谢过程中，醛氧化酶、磷酸丝氨酸转氨酶和吡哆胺5'-磷酸氧化酶的表达减少，其合成产物吡哆醛（VB6主要成分之一）和4-吡哆酸的表达减少，最终证明了VB6可改善慢性肝损伤的炎症细胞侵袭、肝细胞水肿和变性。本研究中“凌云白毫茶”相比于“桂热2号”的通路中的吡哆胺5'-磷酸氧化酶呈现下调表达，共有2个上调基因，4个下调基因，且通过GSEA富集分析可以看出B在该通路中更为活跃。所以从维生素B6对茶叶的影响来看，推测出用“桂热2号”制茶在药用及保健功能上更有效果。

4 结论

本研究对两个茶树品种的维生素B6代谢通路进行转录组分析，结果表明，“凌云白毫茶”与“桂热2号”相比，有2219个差异基因被注释到了138条通路中，这些通路主要包括类胡萝卜素生物合成、植物-病原相互作用、核黄素代谢、单萜生物合成、D-氨基酸代谢等途径。在维生素B6代谢KEGG通路（ko00750）分析中，共有4个酶和6个差异基因参与此通路（2个上调基因，4个下调基因）。通过GSEA分析，发现维生素B6代谢KEGG通路的ES值为0.27，NES值为1.16，NOM p-val值为0.22，FDR q-val值为0.44，FWER p-val值为1。该通路43个背景基因中的CSA031162、CSA013361、CSA011221、CSA034509、novel.20473等五个基因为核心基因，且“桂热2号”在该通路中显得更为活跃。