冷沉淀凝血因子融化后储存温度和时间对凝血因子的影响

王媛 刘国英 孔大为 李建斌 金新莉 张玉红 葛文超 成琳 刘佳璇 刘玉振

(河南省红十字血液中心，河南 郑州 450012)

冷沉淀凝血因子(cryoprecipitated antihemophilic factor，CAF)是新鲜冰冻血浆(fresh frozen plasma， FFP)在1℃～6℃融化后，分离出大部分的血浆，并将剩余的冷不溶解白色沉淀物在1 h 内速冻呈固态的成分血，主要组分是Ⅷ因子、血管性血友病因子、纤维蛋白原(简称Fbg)、纤维连接蛋白、Ⅴ因子和ⅩⅢ因子等，在甲型血友病、血管性血友病、先天性或获得性纤维蛋白原缺乏症、手术大出血、严重创伤及弥散性血管内凝血等患者治疗中取得了明显的效果，而血液质量是保障临床治疗效果的前提，由于CAF 中的Ⅷ因子不稳定，其含量与采集时间、制备方法、速冻温度、CAF 融化后的储存等有关[1-3]。 而CAF 融化后储存方法国内外标准差别太大，欧美是室温保存，我国是冷藏保存，另外，国内对于制备CAF 的原料FFP 报道较多[4-6]，对于CAF 融化后储存温度及时间报道较少[7-8]。 鉴于以上原因，本研究大批量研究CAF 融化后储存不同的温度和时间对Ⅷ因子和Ⅴ因子的影响，为行业标准的制定提供参考依据，以保证临床输血及时、有效、安全，报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

标准品(批号503298)；质控品(批号507921、507795、 507788)；Ⅷ因子试剂(批号560832A、560839、 560809、 560801)； Ⅴ因 子 试 剂(批 号504995A、504990B)； Fbg 试 剂(批 号565179 、565127、565092A、56571A)；PT 试剂(批号568064、565798A、565796A)；ATPP 试剂(批号558665A)；OVBUFFER 缓冲液(批号569916)；CaCl2溶液(批号563894A)；清洗液(批号A2136)，以上均由德国西门子SIEMENS 公司提供。 大容量低温离心机(美国西格玛)；MBF-42 速冻机(卢森堡多美达)；全自动CAF 制备仪(佛山沃塘医疗科技有限公司)；恒温摇摆式水浴箱(美国科瑞特CT-4T.6C)；ALS 多层速冻机(意大利Angelantonilife Science S.r.l 公司，山东威高代理)；CS-2400 全自动血凝仪(日本Sysmex 公司)；HSWS-600 电热恒温水浴箱(上海跃进医疗器械有限公司)；50mL 转移袋(山东威高公司)。

1.2 CAF 制备

1.2.1CAF 制备原料

CAF 的制备原料是FFP，本中心制备CAF 均来源于400 mL 全血，对全血400 mL 采集时间＞13 min进行标识，不能用于制备FFP，采集后储存于冷藏环境中，本站采用ACD-B 抗凝剂(含量100 mL)采血袋，最好在6 h 内完成上层血浆分离并速冻(下层红细胞加入100 mL MAP 保养液，制成悬浮红细胞，保存期由21 d 升为35 d)，从血液采集到完成血浆分离最长时限不得超过18 h。 应当将FFP 快速冻结，建议在1 h 内将中心温度降至-30℃以下。 FFP 在-18℃以下储存，有效期为1 年。

1.2.2CAF 制备方法

1.2.2.1人工虹吸法

将FFP 袋置于1℃～6℃恒温摇摆式水浴箱中，另一空袋悬于水浴箱外，位置低于血浆袋，2 袋之间形成一定的高度落差。 血浆融化后，随时被虹吸至空袋中，当融化至剩下40～50 mL 血浆与沉淀物时，闭合导管，阻断虹吸。 转移至空袋的血浆，制成去CAF 的冰冻血浆。 将血浆与沉淀物混合，最终CAF容量控制在53(48～58)mL，制成CAF，宜在制备后1 h 内完成速冻，并且1 h 内将中心温度降至-30℃以下。 然后CAF 在-18℃以下储存，有效期为1 年。

1.2.2.2仪器虹吸法

打开全自动制备仪器，提前制冷到设定1℃～6℃，按“预温”按钮进行预先制冷，若制冷完成，按“启动”键开始制备，将FFP 在室温下放置5 min，待管路软化后上机制备，依次把血浆联袋放入制备盒中，按下“批量”按钮(所有袋同时进行称重)，进入第二步操作，把三联袋分开，把空袋放入制备盒中，血浆袋放入水浴箱中，软管卡入夹管阀，按下该位置的确认按钮(称量空袋重量)，同样操作其它血袋，如果是三联带，将2 个空袋都放入制备盒，全部血袋放置完毕后，仪器开始处理。 约30 min，当收集CAF 袋子剩余53(48～58)mL 时(仪器提前按重量进行设定)，软管卡自动卡住，此时制备完成的位置会有声音和灯光提示，按一下提示灯光的按钮，取出该位置血袋，进行热合离断CAF 和血浆，宜在制备后1 h 内完成速冻，并且在1 h 内将中心温度降至-30℃以下。 在-18℃储存，有效期为1 年。

1.3 CAF 样本抽检

2021 年6 月—2023 年5 月，每月抽检4袋CAF，并于当月完成检测，2 年共抽检96 袋。

1.4 凝血因子检测

每月抽检储存在-18℃以下的CAF，在37℃水浴箱融化后称重，对外观有轻中度脂血予以标记，每袋融化后的CAF 和2 个50 mL 转移袋用无菌接驳机分装成2 袋两组CAF 各20 mL，1 组放置(4±2)℃(简称4℃)冰箱，另1 组放置(22±2)℃(简称22℃)电热恒温水浴箱中，放置时间段为0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h 各自进行无菌取样2 mL放入试管中，用加样枪在另1 试管中加入样品1 mL 和OVBUFFER 缓冲液3 mL 混匀，并及时在全自动血凝仪进行Ⅷ因子、Ⅴ因子以及Fbg 检测，打印结果留存记录，计算结果乘以4。 Ⅷ因子和Ⅴ因子计量单位均为IU/袋，Fbg 计量单位为mg/袋。

1.5 统计学分析

96 袋CAF 实验完成后，从其中随机选取60 袋无轻中度脂血CAF 实验数据进行分析，采用SPSS21.0 统计软件进行均值t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义；P＜0.01 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ⅷ因子含量检测结果

融化后CAF 0h 检测Ⅷ因子、Ⅴ因子以及Fbg的平均值分别为(118.62±52.82)IU/袋、(41.19±10.37)IU/袋、(268.86±89.65)mg/袋，变异系数分别是44.53%、25.18%、33.34%，其中Ⅷ因子含量变异系数最大。 融化后CAF 中的Ⅷ因子含量，2 组储存结果比较，在4℃24h 及22℃48h，Ⅷ因子含量均有显著统计学意义(P＜0.01)，且在22℃储存，Ⅷ因子衰减速度更慢(表1)。

表1 CAF 融化后贮放不同的温度及时间对Ⅷ因子结果的影响(IU/袋，n＝60)Table 1 Influence of different storage temperature and time on the results of FactorⅧafter CAF melting (IU/bag， n＝60)

2.2 Ⅴ因子含量检测结果

融化后CAF 中的Ⅴ因子含量，两组储存结果比较，在4℃48h Ⅴ因子含量有统计学意义(P＜0.05)，22℃48hⅤ因子含量有显著统计学意义(P＜0.01)，且在22℃储存，Ⅴ因子衰减速度更快(表2)。

表2 CAF 融化后贮放不同的温度及时间对V 因子的影响(IU/袋，n＝60)Table 2 Influence of storage temperature and time on V factor after CAF melting(IU/ bag， n＝60)

2.3 Fbg 含量检测结果

融化后CAF 中的Fbg 含量，两组储存结果比较，各时间段与0h 含量比对均无统计学意义(P＞0.05)，说明Fbg 是比较稳定的凝血因子(表3)。

表3 CAF 融化后贮放不同的温度及时间对Fbg 的影响(mg/袋，n＝60)Table 3 Effects of storage temperature and time on Fbg after melting CAF (mg/ bag， n＝60)

3 讨论

CAF 是临床输血治疗的一种重要血液成分，主要用于预防和治疗出血性疾病。 如何避免融化后CAF 凝血因子下降，《美国AABB 技术手册》规定融化后的CAF 在20℃～24℃储存，在开放系统中汇集的，储存期为4 h，单袋或采用经FDA 批准的无菌接驳装置汇集的，储存期为6 h[9]。 《英国输血服务指南》规定CAF 一旦解冻，该成分不得再冷冻，应立即使用，如果延迟是不可避免的，在室温下储存，并在4 h 内使用[10]。 我国对融化后CAF 的储存规定:在2℃～6℃储存，储存期为24 h[11]。 CAF的制备原料是FFP，Cardigan 等[12]报道全血储存于4℃18～24 h 分离的血浆对于绝大多数需要输注FFP的患者是可以接受的。 Wilsher 等[13]发现全血储存于22℃24 h 分离的血浆中Ⅷ因子含量仍符合英国标准。 为了验证CAF 融化后的储存条件，本研究将CAF 融化后分成2 组，分别放置4℃和22℃储存，经过48 h 放置，检测凝血因子的变化。

本研究显示，60 份融化后的CAF 0 h 检测，Ⅷ因子、Ⅴ因子以及Fbg 的平均值分别是(118.62±52.82) IU/袋、(41.19±10.37) IU/袋、(268.86±89.65)mg/袋，变异系数分别是44.53%、25.18%、33.34%，其中Ⅷ因子含量变异系数最大，这可能与献血者血型、性别以及CAF 制备方法等差异相关[14-15]，由于O 型Ⅷ因子含量最低，《英国输血服务指南》7.18 规定混合输注CAF，应来自O 型和非O 型CAF 的等量混合，国内对这方面没有规定。CAF 中的Ⅷ因子2 种(4℃和22℃)贮放温度24 h浓度下降率(20.46%和14.39%)低于文献报道[16]，可能与本研究标本数量大和去除轻中度脂血样本等有关。

表1 显示，CAF 融化的2 组贮放温度Ⅷ因子含量均随贮放时间而下降。 4℃24 h 和22℃48 h 贮放与0 hⅧ因子含量比对，均有显著统计学意义(P＜0.01)，说明22℃贮放Ⅷ因子含量衰减率慢于4℃，原因可能是CAF 经过37℃融化后，其内部温度高于15℃以上，如果将融化后的CAF 重新放在4℃冰箱储存，随着时间延长超过12 h，CAF 袋内温度逐渐下降到4℃，这时的温度又达到Ⅷ因子重新析出临界温度，相当于反复冻融，导致析出的Ⅷ因子聚合体增加，从而使Ⅷ因子含量加速下降，这也验证了欧美国家CAF 融化后不冷藏而采取室温保存的规定；另外，如果制备CAF 原料FFP 中的血小板(英国规定血小板＜60×109/L[17]，我国没有相关规定)含量高，导致CAF 中的血小板浓度也高，过多的血小板在4℃聚集性增加，再加上和Ⅷ因子析出的白色物结合，激活凝血途径，导致细小纤维蛋白微聚物析出增多[18]，从而导致Ⅷ因子含量下降。反观融化后的CAF 在22℃贮放可以克服上述缺点，阻止了Ⅷ因子析出和血小板聚集，大大延缓了Ⅷ因子含量下降率，因此，本研究CAF 融化后贮放于22℃与美国和英国贮放室温是接近的，而不是我国目前融化后CAF 在2℃～6℃储存24 h，因此，建议我国对融化后的CAF 储存方法进行改进，首选储存4℃，最长储存时间不超过12 h，次选储存22℃，最长储存时间不超过24 h。 表2 显示，融化后的CAF，2 组贮放温度Ⅴ因子含量均随贮放时间而下降，证明Ⅴ因子也是不稳定的凝血因子，与文献报道有一致的[19]也有不一致的[20]。 但Ⅴ因子下降速率没有Ⅷ因子明显，且4℃和22℃贮放24 h与0 hⅤ因子含量比对，均无统计学意义(P＞0.05)，当超过48 h 2 组贮放才均有统计学意义(P＜0.05)。 4℃贮放Ⅴ因子含量衰减率要慢于22℃，原因是如果将融化后的CAF 重新放在4℃冰箱储存，CAF 中的Ⅴ因子在4℃时不会析出白色物质以及微聚物，从而不会导致Ⅴ因子下降速率增加。 表3显示，2 种贮放温度，Fbg 48 h 内与0 h 含量比对均无统计学意义(P＞0.05)，说明Fbg 是比较稳定的凝血因子。

综上所述，CAF 融化后储存22℃Ⅷ因子衰减速度比4℃更慢。 CAF 融化后应尽快输注，如果延迟不可避免；若延迟时间＜12 h，采用4℃保存，若延迟时间超过12 h＜24 h，采用22℃保存，这两种保存方法其实并不矛盾，是由CAF 中的Ⅷ因子在4℃析出白色物质这物理特性决定的。 将CAF 融化后由目前国标储存4℃24 h 缩短到12 h；或者由目前欧美标准22℃存放6 h 延长到24 h，这两种方法目的都是为了减少Ⅷ因子重新析出造成的反复冻融，从而导致Ⅷ因子失活，为临床和决策者对融化后CAF保存提供了理论依据，既保证了CAF 中的Ⅷ因子活性的安全有效性，又减少了血液资源的浪费。