同种异体富血小板血浆在创面修复中的应用及展望

刘凌 卢黎琦 刘曹毅 张静薇

(1.中国融通医疗健康集团有限公司 成都八一骨科医院 康复医学科，四川 成都 610012；2.成都市第二人民医院 输血科)

自1977 年，Harke 等[1]首次从全血中分离制备富血小板血浆(platelet rich plasma， PRP)在心脏外科手术患者中获得良好的治疗效果后，PRP 研究已进行了40 多年。 自体PRP 在骨科手术、眼科、牙科和皮肤创面修复中已被公认是安全有效的治疗方法[2-5]。 同种异体PRP(以下简称异体PRP)因其在免疫原性、法律和伦理学的担忧，研究相对有限。 异体PRP 在临床应用的有效性和安全性仍有待考证。难治创面因再上皮化困难，感染、截肢、骨髓炎或全身感染的风险较常规创面增加，且持续的疼痛和精神压力进一步削弱了患者的生活质量并增加了社会医疗负担[6]，有必要采用疗效更可靠的新兴治疗手段。 鉴于部分难治性创面患者不适合采集自体PRP，来源于血库或特定捐赠者的异体PRP 因具有相对稳定的供应量和可靠的质量对此类患者可能具有积极意义，也有利于有效地利用血液资源。 因此，本文旨在阐述异体PRP 在难治性创面愈合中的有效性和安全性，为其应用于创面修复提供依据。

1 同种异体PRP 的创面修复原理

难治性或慢性创面周围生物活性因子的局部浓度、稳定性和生物利用度显著降低，间充质细胞表现型改变；伴随创面处基质金属蛋白酶的局部活性增高，抑制细胞增殖和血管生成，导致其止血、炎症、细胞增殖、迁移和组织重塑/成熟等阶段存在不同程度的交叉、重合和延迟[7-9]。 与自体PRP 类似，异体PRP 通过提供富集生长因子、高浓度细胞因子和抗菌蛋白等，促进细胞增殖、分化、基质合成、组织再生和修复以促进伤口愈合[8-9]。 PRP 促进创面修复的原理简述如下:1)PRP 富含分泌生长因子和功能蛋白质，包括血管内皮生长因子、血小板源性生长因子和表皮生长因子等可促进成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和间充质干细胞(MSCs)等细胞的增殖、分化和迁移[5，9-10]；2)PRP 中的纤维蛋白原、纤维连接蛋白和纤维粘连蛋白作为细胞粘附分子促进上皮和血管细胞的迁移和稳定，以及维持因子持续释放[7，11]；3)PRP 不仅可以通过释放多种抗菌肽通过细菌内外膜的通透性，还可以阻碍蛋白质合成以及影响DNA 合成或抑制酶活性，产生抗菌和辅助抗生素的作用[9]；4)参与止血、血管生成、胶原合成、受损组织的血管新生和重建[12]。

2 同种异体PRP 治疗的优越性和局限性

2.1 自体PRP 临床应用的局限性

在很大程度上，PRP 疗法的有效性依赖于足够血小板的数量的和良好的血小板功能[13]。 遗憾的是PRP 的数量和质量不可避免地受到PRP 的制备和激活方式以及供体的性别、年龄和伴随疾病状态等的干扰[14-15]，举例而言:男性捐献者的PRP 含有更多的抗炎症因子和生长因子[16]；老年捐献者的血小板计数相对中年人减少且长期存活率降低[15]；合并糖尿病的供体相对健康供体具有表达减少的血小板衍生生长因子和降低的细胞增殖活性[17]。 由此，糖尿病、动脉硬化闭塞症、慢性静脉功能不全以及营养不良等合并症虽然并非采集PRP 的绝对禁忌，却因伤口炎症失衡、血栓形成、生长因子分泌减少风险增高而易于发生延迟修复[9，18]；同时，采集自体PRP 过程中伴随的红细胞和白细胞丢失可能会进一步导致健康状况恶化[19]。 此外，部分临床人群还存在采集自体PRP 的相对或绝对禁忌:1)血小板计数(Plt) ＜120×109/L 或贫血[8]；2)出凝血异常，如存在凝血因子或者血小板缺乏或功能异常的出血性疾病；使用影响出凝血功能以及抗血小板功能药物等[8]；3)有效循环血量不足，如大量失血、心血管疾病和严重烧伤等[20]；4)中重度全身感染、营养不良和耗竭体质等慢性疾病，如恶性肿瘤[18]；5)采集或应用衍生物存在安全性风险，如新生儿和妊娠期妇女[19]。 异体PRP 的运用可能对此类患者具有积极的临床意义。

2.2 异体PRP 临床应用的理论优势

基于150 多年前的异体共生实验，当两只动物共享同一套血液循环时，年老动物的大脑、心脏和肌肉功能都获得了不同程度的改善，提示年轻动物血液中含有促进再生和修复的分子[21]。 Katcher 等[22]通过定期向中年大鼠注射来自年轻大鼠的纯化血浆，观察到后者生理年龄降低和生存期延长，进一步提示年轻动物血浆中含有能促使受体动物干细胞恢复活力的特殊因子。 由此推测来自特定的年轻供体的异体PRP 可能比老年自体PRP 具有更丰富的活性成分。 不仅如此，源自血库健康献血者的PRP 可能具有更稳定和可重复的治疗效果，原因如下:1)捐献者的病理因素影响少[18]；2)制备条件标准，如离心速率、离心温度、处理技术以及防腐溶液的组成在欧美以及我国的制备标准中均有明确规定，以避免因离心速度导致的PRP 激活[23-25]；3)细胞成分稳定，具有高度标准化的血小板计数、剩余白细胞和红细胞含量[23]；4)供应相对丰富。

2.3 异体PRP 临床应用安全性的刍议

总所周知，异体PRP 的输注不可避免地存在不同程度的免疫原性。 血小板在激活时释放可溶性介质，如趋化因子、细胞因子和抗菌肽，与内皮细胞和白细胞相互作用，深度参与皮肤的先天和适应性免疫反应[26]。 这些免疫反应受刺激物、效应物、协同分子和特定组织的影响，释放的大量免疫介质与各种免疫细胞会产生复杂的相互作用[27]。 因血小板输注产生的免疫反应具有捐献者抗原特异性，主要为血小板不耐受、实体器官移植排斥反应以及输血相关的免疫调节(TRIM)效应[28-30]。 血小板不耐受性主要由Fc 受体介导，可使用CTLA4-Ig 进行共刺激阻断实现预防[31]。TRIM 效应则依赖于MHC Class Ⅰ分子[32]。 大部分MHC Class Ⅰ分子源自白细胞，少部分源自新鲜的血小板；当血小板因老化或者其他干扰不表达MHC Ⅰ分子则失去诱导TRIM 的能力[32]。 就血小板输注而言，专家建议选择与受体匹配的人类白细胞抗原或者选择供体—受体交叉匹配的单一供体的低白细胞的血小板；如有必要还可以预先进行紫外线照射以降低免疫原性[28，33]。 PRP 中的残留白细胞含量对创面愈合促进或抑制作用尚存在争议[34]。 白细胞既可能通过激活先天免疫系统发挥抗感染作用[35]；也可能因杀菌作用产生的大量活性氧损伤新生的细胞[36-37]。 研究人员在同等条件下给小鼠输注少白细胞的异体PRP 或者未处理的异体PRP，发现前者循环中产生的同种抗体和脾脏细胞因子反应低于后者，提示少白细胞的异体PRP 可以防止同种异体免疫反应，并降低同种异体抗体的产生和体外引发的二次细胞因子反应[29-30]。

虽然研究数量较少，异体PRP 的非输注应用同样存在局限性的免疫源性。 在首例关于异体PRP 免疫原性的研究中，研究人员对兔子进行PRP 局部肌注，使用流式细胞术观察到其血液中CD4＋淋巴细胞在第1 周轻微上升后逐渐减少，到第8 周恢复正常；CD8＋淋巴细胞无明显差异；组织学分析显示，注射局部第一周皮肤出现轻微炎症，以后则无明显改变[38]。 与之类似，异体PRP 肌注后的巴马小型猪在第一周左右也出现轻微的局部和全身免疫原性反应，但在注射后4 周反应基本消失[39]。 由此我们推测异体PRP 应用于创面修复仅存在局限性的免疫原性，原因如下:1)大部分在应用于创面PRP 会在局部被快速降解和利用，能进入宿主循环系统的白细胞和具有MHC Ⅰ类分子的血小板极其有限；2)PRP 局部应用通常采用激活剂激活促使其释放活性因子，激活的PRP 表面抗原结构和表达水平发生变化，导致免疫原性降低[19，40]；3)局部应用的PRP 会在数周内被完全降解和吸收，从而消除了慢性免疫反应的可能性[18，41]。值得引起注意的是，虽然源于ABO 和Rh 血型匹配的健康供体经过标准化制备获取的血制品具有稳定可靠的质量，其有限的免疫原性也可能并非应用异体PRP 的主要障碍，但异体血制品的应用依然存在发生血源性传染病的风险[42]。

3 同种异体PRP 在创面修复中的应用

为了评估同种异体PRP 在创面修复中的应用，我们在OVID Medline、PubMed、万方和知网上检索了关键词为“伤口、溃疡、病变、皮肤和皮肤、烧伤、创面”以及“PRP、富血小板血浆、富血小板纤维蛋白”和“同源/同种异体的、血库”的非综述性中/英文论文。 本文回顾了20 项临床研究和8 项动物研究。 纳入的所有研究均采用小剂量局部涂抹或注射方式，尚无静脉输注的研究报告，也未有因局部应用而导致短期局部和全身反应、感染或因不良事件而退出的报告。

20 项临床研究中有8 项随机对照研究，1 项队列研究，6项病例系列和5 项病例报告。 就异体PRP 来源而言，基本源于血库或者血液中心，个别源于亲属捐赠；就制备方式和血型而言，源于血库的血小板较少提及离心方式、血小板起始浓度和PRP 终浓度，少部分研究明确了血小板的ABO 和Rh 血型；就激活方式而言，所有研究均采用葡萄糖酸钙、凝血酶联合或单独使用以激活PRP；就治疗方式而言，除1 例研究采用激活的PRP 局部注射，其余研究均采用激活的PRP 局部外敷[43]，所有对照组均采用常规换药；换药频率大多根据创面实际情况从隔天一次到每周两次，或者更少；观察结果多为创面早期肉芽生长和中晚期的愈合率和愈合时间，相关研究结果详见表1。

表1 异体PRP 用于创面修复的干预措施、疗效和不良反应的文献复习Table 1 Literature review of interventions， efficacy and adverse effects of allogeneic platelet-rich plasma for wound repair

就研究质量而言，受限与对象数量较少且创面类型分类较多，妨碍了对其进行Meta 分析。 整体人数超过40 人的随机对照研究仅有5 项，其中糖尿病溃疡2 项、其他类型创面及溃疡3 项。 Jeong 等[44]观察到12 周后糖尿病溃疡实验组的完全愈合率、完全愈合时间和满意度均高于对照组。陈若曦等[43]也观察到糖尿病溃疡治疗组治疗1 周后创面修复快、5 周后愈合率更高且总愈合时间更短。 首例应用异体PRP 治疗下肢慢性溃疡的前瞻性随机对照双盲试验发现，实验组在采用源于血库的ABO 和Rh 血型相合血小板6 个月后的创面愈合率高于采用水凝胶的对照组[25]。 我国学者则进一步通过相对客观的评分量表对实验对象进行疼痛程度评测，由此认为PRP 不仅利于早期修复和提高愈合率，还能有效缓解疼痛[45]。 Liao 等[46]随机对照试验采用30 例患者直系亲属外周血二次离心提取的PRP 对创面局部注射病例，发现30 d 愈合良好，6 个月完全愈合，且随访6 个月—4年无溃疡复发。 该研究首次报道了异体PRP 治疗的长期预后，遗憾的是该研究中未提及随机分类的方法，且患者创面的位置、大小、既往治疗时间和方法，原发疾病或者伴发疾病存在一定异质性。 He 等[41]的队列研究首次比较了自体PRP 和异体PRP 治疗效果。 研究者根据患者的意愿、营养和感染状况将糖尿病溃疡患者分为血库异体PRP 组(20例)、自体PRP 组(25 例)和常规治疗组(30 例)，研究发现自体和异体PRP 组创面愈合时间均显著短于常规治疗组，但两组间无差异。 在病例系列的研究中，研究人员纳入了包括糖尿病溃疡、静脉溃疡、压力型褥疮、复发溃疡、感染创面在内的等多种常规治疗难以治愈的创面。 此类研究的纳入的病例数约10～20 例，较为一致地显示PRP 可促进创面面积缩小和缩短愈合时间，并未报告严重不良反应；但其纳入研究对象及创面类型的异质性明显，且PRP 的制备、激活和治疗方式均存在差异，结果判断标准也存在一定的主观性。 异体PRP 创面治疗还有部分个案报告，涉及创面类型包括头颈癌患者化疗以后的放射性皮炎创面[47]， 因动脉粥样硬化导致的肢体缺血坏疽[48]，动静脉瘘切除术后持续感染的不愈合创面[49]，继发带状疱疹创面[50]和白塞氏病难治性外阴溃疡[51]各1 例。 绝大部分研究认为异体PRP 作为一种较安全的替代方法可促进创伤修复，也有少部分研究认为其并未明显优于传统疗法。 Scevola 等[52]的研究认为初始两周内，PRP 组的创面愈合效果优于常规治疗的对照组，但二组的长期效果并无差别。 Oliveira 等[53]采用16 名参与者和共计21 个溃疡比较了使用PRP 的治疗组和使用羟基淀粉胶贴的对照组治疗静脉溃疡的效果，也认为两组间溃疡面积减小的效果无明显差异。

就动物实验而言，包括新西兰兔[54-56，20]，猫[37]，狗[57]以及小型猪[39]等的研究显示:不论是自体、同种异体还是异源的PRP 或其衍生物在创面修复方面均具有积极意义，并且未报告不良反应或免疫原性。 这些研究普遍认为异体PRP可以促进创面和毛发再生[57]，促进成纤维细胞数量和新生血管形成[56]，抑制感染创面葡萄球菌的数量[20]，促进肉芽形成减少纤维沉积物[37]，Abegão 等[55]采用了兔子分别作为自体和异体PRP 的供体，犬作为异源PRP 供体。 通过对表皮变性、坏死和再生，以及皮下水肿、出血、新生血管化程度和炎症浸润的纤维化类型进行评估，发现不同来源的PRP在改善和加速创伤愈合过程具有相似的效果，并且使用异体和异源PRP 均未导致感染或过敏反应。

4 异体PRP 在创面修复中的展望

由于采用异体PRP 治疗通常为无法采用自体PRP 或者常规治疗失败的替代手段；实验研究数量较少，且大多未严格采取随机分组并有效应用盲法；患者或创面类型异质性较强；异体PRP 的来源、组成、剂量或治疗方案缺乏一致性，研究中纳入患者的一般情况、损伤描述、治疗方案、术后护理，治疗有效性、安全性包括副作用在内等细节内容不够详尽从而难于相互对比。 为数不多的宣称的“临床随机试验”也均未能根据CONSORT 声明进行报告，也缺乏预先注册的相关信息，由此减低了研究的透明度和可重复性[2]。虽然目前的研究中尚未发现与免疫或血清学相关的不良反应，但临床使用依然需要慎重，必须通过病毒检测和/或灭活来最大限度地降低血源性病原体和同种异体免疫的风险，异体PRP 可能更加适用于身体和精神状况较差的特殊疾病或老年患者，以及需要长期治疗的患者[9]。 但其在老年人、糖尿病患者等特殊患者群体中的免疫作用仍需更加深入的研究，一旦使用更高的频率或更大累积量的异体PRP 是否会导致更多的不良反应[18]。

PRP 制备过程中的质量控制是确保其安全和疗效的重要环节。 质量控制内容涉及血小板来源、制备设备和技术、制备流程和激活方式，以及最终血小板浓度范围、特定生长因子和细胞因子水平、微生物、白细胞和红细胞混入量以及纤维蛋白基质的密度和组成[8，34]。 无论自体和异体PRP，均尚无最佳制备方案以最大限度提高血小板产量，其使用方式、频率和剂量也尚无统一标准[36，58]。 专家建议获取PRP首选采用成分血采集机和专用血袋的封闭采集制备；次选PRP 满足封闭制备条件专用套装制备；不推荐选择开放性操作试管法手工采集制备以满足充分而适度离心避免激活和微生物污染[8]。 虽然手工法和设备法制备的PRP 基本能满足计数需要，但是不同离心力和离心时间制备的PRP 具有不同的细胞残留量和生长因子释放量[11]。 不同激活方法也会影响PRP 释放的生物活性因子的速率和浓度。 通常情况下，较高浓度的钙和凝血酶会导致生长因子快速释放，而较低浓度会导致生长因子更缓慢、逐渐释放[59]。 相对于采用氯化钙活化的PRP，采用凝血酶活化的PRP 具有较快的凝固速度[60]。 有专家建议在皮肤应用时选择快凝胶制剂，在软组织应用时选择慢凝胶制剂，在静脉内或关节内应用时选择非凝固制剂[36]。 此外，异体PRP 的非输注性临床使用还需要符合伦理和法律规定，如我国施行无偿献血制度，《献血法》和《临床输血技术规范》等规定无偿献血者捐献的血液一般也只能用于临床具有适应证的患者输注治疗，加之血小板制剂的保存期短，长期供不应求[61]。 但若血站采集的200 mL 全血能够分离制备出20 mL 浓缩血小板，则完全满足小创面或关节注射使用，提高成分血的使用率和提升成分血的价值[61]。

因此，为了提高异体PRP 的研究质量。 我们提出如下建议:1)报告伦理和血液制品关于血型、血源性传染病等安全相关特征；2)报告供体全血和获得PRP 的基本血细胞计数并比较以获得血小板富集和恢复值；3)报告制备PRP 的设备(品牌型号、关键参数)，制备方案(抗凝血类型、离心时间和离心力)和活化方式(冻融、氯化钙、凝血酶等激活剂及配比关系)[36，58]；4)报告PRP 中残留的白细胞以及红细胞，以评价其可能对PRP 中存在的生长因子和细胞因子的类型和数量造成的干扰[8，34]；5)报告具体实验设计、患者一般情况、损伤描述、其他干预措施、术后护理，有效性、安全性和副作用，以增加实验的透明度、可靠性和可重复性。

5 结论

综上所述，异体PRP 对创面愈合的具体机制仍需探索。目前的体内研究初步认同，其可作为特殊情况下，自体PRP的有效替代。 然而，目前关于异体PRP 在创面修复中的疗效和安全性的研究还受限于其研究数量和质量，需要进行更多质量良好、低偏倚风险的大规模随机对照研究，为制定行业规范或标准提供依据。 鉴于异体PRP 可从血库全血制品中大规模生产，在充分考证伦理、法律法规的限制，以及传染性和免疫性因素的前提下，同种异体PRP 具有巨大的研究潜力和社会效益，值得更深入地探索。