血红蛋白类氧载体在肿瘤治疗领域中的应用进展

郑诗凡 王红 徐莹璨 吴嘉康 周文涛 郝莎莎

(中国医学科学院北京协和医院输血研究所，四川 成都 610052)

1 HBOCs 研究现状

自20 世纪早期，随着现代医学发明输血以来，全球对于血液资源的需求给血液供应带来巨大压力[1]。 血红蛋白类氧载体(hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs)作为1种人工血液代用品，以红细胞的主要组成成分血红蛋白(hemoglobin，Hb)为原料，经修饰后在机体内能够携/释氧的载体粒子，具有无需交叉配血、低毒性、易保存等优点，因此收到广泛关注。 Hb 是红细胞在机体内携/释氧的主要功能蛋白，虽然无红细胞膜的血红蛋白仍具有运输氧气的能力，然而，裸露在血液中的纯化血红蛋白会受到人体免疫系统的排斥，此外还存在如肾毒性、易引起血管内胶体渗透压升高和易引起血管收缩等缺点。 因此，为了使纯化血红蛋白能够安全有效地应用于人体，通常需经过化学修饰或包封等处理。 常用方法为:通过交联策略或与其他聚合物偶联来对Hb 进行化学修饰，或以脂质或聚合物胶囊形式对Hb 进行包封[1]。

HBOCs 作为1 种重要的血液代用品得到深入持续研究，并在不断探索更广泛的应用范围。 HBOCs 因其无细胞结构的特性具有较高的释氧速率[2]，即使仅输入较低浓度，也能迅速释放大量氧气到机体内[3]。 此外，因其纳米级粒径和低粘度的特性，HBOCs 可通过正常红细胞难以通过的微循环末梢，进而有效增加血液供应[4]。 利用上述特性，HBOCs 不仅可作为红细胞替代品运用到输血和缺血性急救，还能作为治疗药物应用于一些新的领域如肿瘤治疗、伤口愈合、器官移植灌注等发挥作用[5]。 研究发现，HBOCs 可进入红细胞无法达到的实体瘤内部紊乱微小血管网，改善肿瘤内部缺氧微环境，提高肿瘤组织的氧合水平，具有重要的研究价值和应用前景。 针对当前研究热点，本文综述了缺氧对肿瘤的影响以及HBOCs 在肿瘤治疗领域的应用进展。

2 肿瘤缺氧微环境

2.1 肿瘤缺氧微环境

与正常细胞相比，肿瘤细胞处于无限分裂和增殖状态，能够自主形成新生血管以获取营养，容易发生侵袭和转移。肿瘤细胞与周围的多种间质细胞(内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞等)和细胞外基质互相作用、共同构成1 个复杂的有机体，即为肿瘤微环境(tumour microenvironment，TME)。与正常组织相比，肿瘤组织最终呈现缺氧、酸性等显著特点[6]，实体瘤内部氧分压低于10 mmHg[7]。 研究人员发现在缺氧环境中生长的癌细胞，其在肿瘤发展中增殖、转移、侵袭性明显高于正常含氧量中生长的癌细胞[8-10]。 缺氧微环境与肿瘤的发生、生长及转移密切相关会显著降低临床放化疗或免疫治疗等抗肿瘤治疗的效果。 因此，改善肿瘤缺氧或可提高肿瘤治疗效率。

2.2 缺氧在肿瘤进展中的作用

缺氧在肿瘤进展中的发挥着重要作用，与肿瘤缺氧微环境密切相关的转录调控因子是缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)，肿瘤细胞在低氧条件下的存活机制与HIF 的表达密不可分[11]。 HIF-1α 是1 种典型的低氧内源性生物标志物，在缺氧环境中的氧分压下降时被激活[12]。 在TME 中，HIF-1α 作为细胞平衡和缺氧诱导基因表达的中心调节因子，可调控基质金属蛋白酶2、CXC 族趋化因子受体4(CXCR4)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)等一系列与肿瘤进展有关的靶基因的转录[8-10]。此外，肿瘤缺氧还通过HIF-1α 依赖性机制调控免疫抑制代谢物-细胞外腺苷增加[13]。 腺苷的积累可直接引起关键免疫细胞群的改变:干扰效应细胞(效应T 细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞等)的存活、迁移和抗肿瘤免疫功能[14-16]，促进免疫抑制细胞[调节性T 细胞(Tregs)、髓源性抑制细胞(myeloid-derive dsuppressor cells，MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)等]的分化、募集和免疫抑制功能[17-18]。 除此之外，缺氧时HIF-1α 会快速、显著和选择性上调肿瘤细胞上PD-L1 的表达，同时在缺氧条件下增强MDSCs 介导的T 细胞活化，并伴有IL-6 和IL-10的下调[19]。 总的来说，缺氧会通过影响肿瘤血管生成、肿瘤转移、免疫逃逸等各方面影响肿瘤的发生发展。 考虑到缺氧TME 在肿瘤进展和治疗抵抗中的核心作用，研究者们致力于尝试各种方法来克服肿瘤缺氧微环境，进而提高癌症治疗的敏感性[20]，包括可提高肿瘤部位氧合能力的高压氧疗法、可释氧纳米颗粒联合疗法、靶向缺氧相关途径的抑制剂等[21-23]。 越来越多的实验数据已经认识到氧对肿瘤治疗的重要性。

3 HBOCs 在肿瘤治疗领域的临床前研究

尽管HBOCs 具有低粘度、纳米级粒径等优势[4]，为达到更高效、精确治疗肿瘤的目的，研究者们还通过修饰或组装方式使HBOCs 具有长循环、靶向性、共负载药物等特点，以探索HBOCs 在放化疗、免疫治疗等多肿瘤治疗领域的应用前景。

3.1 HBOCs 增效化疗

缺氧导致的肿瘤致密紊乱的血管系统不仅会影响药物的输送和摄取，还会加重肿瘤对化疗药物的耐药性[24]，因此缺氧被认为是化疗耐药的重要因素之一。 修瑞娟团队发现PEG 修饰的血红蛋白溶液联合顺铂治疗可明显降低宫颈癌移植瘤小鼠的肿瘤大小，且高浓度PEG-HB(0.6 g/kg)治疗效果优于其余实验组，同时，该团队后续发现经HBOCs 增敏治疗的小鼠HIF-1α 和多耐药基因MDR1 表达降低[25-26]。Kwan Man 等[27]在2014 年通过在肝癌动物模型中注射牛源性血红蛋白OC89，证实了其可以增加肿瘤局部的氧供应，增强肝癌对于化疗的敏感性。 Lee NP 选取了对化疗药具有不同抗性的SLMT-1 移植瘤HKESC-2 移植瘤，发现HBOCs可降低低氧标志物HIF-1α 的水平，使原本更具抗性的SLMT-1 肿瘤对5-氟尿嘧啶敏感[28]。 黄宇彬团队利用血红蛋白自身可靶向肿瘤微环境中表达CD163 的M2 型肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAM)的特性，制备可靶向耗竭M2-TAM 和重编程缺氧微环境的纳米红细胞，该纳米红细胞可共负载化疗药多柔比星(DOX)，不仅提高了化疗药物的生物利用度，还实现了药物靶向治疗[29]，这对癌症治疗和血红蛋白类氧载体的发展都是突破性的。

HBOCs 增效化疗的可能机制为:1)HBOCs 粒径小，可以进入红细胞难以到达的肿瘤核心部位进行供氧；2)HBOCs 没有细胞结构，能快速增加缺氧部位组织氧分压，促进HIF-1α 的降解，进而调控血管内皮生长因子的表达，使肿瘤血管正常化，从而提高化疗药物的递送效率；3)HBOCs恢复供氧使耐药标志物MDR1 表达降低，进而降低化疗药物耐药性。

3.2 HBOCs 增效放疗

放疗杀伤癌细胞原理可简单分为直接杀伤作用和间接杀伤作用，直接杀伤是指辐射可直接破坏肿瘤细胞DNA 结构，导致细胞坏死或凋亡，间接杀伤是指放射疗法中氧气所产生的ROS 对肿瘤细胞的杀伤作用[30-32]。 实体瘤缺氧被认为是临床放射抵抗和失败最重要的原因，改善肿瘤部位氧合被认为是有效的放射增敏方法[33]。 Raabe 等[34]于2009年首次在照射治疗前使用脂质体包裹的血红蛋白(0.3 g/kg)对R1H 移植瘤小鼠进行放疗增敏研究，该实验中，HBOCs 治疗组虽然能改善肿瘤氧合，但只有轻微肿瘤抑制作用，并无统计学差异。 Chiko 等[35]在2012 年利用脂质体包裹血红蛋白协同放射线治疗SCCVII 肿瘤小鼠，结果表明高浓度脂质体血红蛋白溶液(0.6 g/kg、 1.2 g/kg)均可显著性降低肿瘤大小，而低浓度溶液(0.3 g/kg)在肿瘤治疗中无效果。 这表明HBOCs 对放疗增敏无效可能与HBOCs 的注射剂量及频率、肿瘤的种类不同等因素有关，且HBOCs 在增敏放疗治疗中呈剂量-效应关系。 2022 年，高若玲等[36]开发了1 种基于Hb 和姜黄素的自组装纳米颗粒，可通过抑制细胞增殖和DNA 损伤修复以及诱导细胞凋亡来增强缺氧性肝癌细胞的放射敏感性，进一步优化了HBOCs 放射增敏治疗方案。

HBOCs 增效放疗的可能机制为:1)HBOCs 提供肿瘤氧合，降低肿瘤组织中低氧细胞的数量，从而提升放射敏感；2)HBOCs 为肿瘤组织提供活性氧，促进放射治疗中氧自由基对肿瘤细胞DNA 的攻击。

3.3 HBOCs 增效动力学治疗

光动力疗法(photo dynamic therapy，PDT)由光敏剂、光和氧气3 种基本成分组成，三者组合形成的光化反应最终产生可迅速引起细胞凋亡、坏死或自噬的大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)物质[37-38]。 然而，肿瘤部位的缺氧微环境极大程度限制了PDT 的治疗效果， PDT 的进行伴随氧气不断被消耗，这将会加重治疗区域的缺氧状态，降低治疗效果[39]。 为克服这一难题，蔡林涛团队设计了包载血红蛋白和光敏剂吲哚箐绿的纳米红细胞，Hb 能直接对肿瘤部位供氧，在光敏剂和光照条件下产生大量单线氧并抑制肿瘤生长[40]。 该团队后续设计的以Hb 为主的纳米粒子还能触发特异性抗肿瘤免疫应答，在结肠癌和三阴性乳腺癌等多种肿瘤模型均表现出有效的肿瘤抑制能力[41-42]。 王利群团队制备的共负载光敏剂ZnPc 的血红蛋白类氧载体(ZnPc-loaded HbMs)也证实HBOCs 可有效提高PDT 治疗效果[43]。

声动力疗法(sonodynamic therapy， SDT)是1 种利用超声激活声敏剂进行抗肿瘤治疗的新型治疗方式。 Yuan等[44]发现，含有天然金属卟啉的血红蛋白比传统有机声敏剂更有潜力，Hb 可有效地避免了疏水性卟啉的量子产额堆积所导致的活性氧含量低的问题。 郭立俊团队通过脂质体包封Hb 和声敏剂构建Au＠TiO2-Hb-Lip 纳米载体[45]，脂质体可保护Hb 不被机体清除，同时延长了Hb 的体内循环时间，该粒子可解决肿瘤微环境缺氧问题，并应用在肿瘤深部治疗，具有较好的抗肿瘤效果。 王筱冰团队研究表明，超声辐照可有效放大纳米氧载体的氧合作用，促进Hb 价态转换，进而介导铁死亡途径并对抗肿瘤效应产生免疫调节作用，表现出显著的体内抗肿瘤效果[46]。

HBOCs 增效动力学疗法的可能机制为:1)HBOCs 的直接供氧可为PDT 提供工作原料、增加PDT 工作效率； 2)HBOCs 可有效地避免疏水性卟啉堆积，增加SDT 工作效率；3)HBOCs 能一定程度触发免疫反应，增强抗肿瘤疗效。

3.4 HBOCs 增效免疫治疗

免疫治疗能触发机体免疫系统，实现特异性识别、追踪、破坏肿瘤细胞，是较为理想的肿瘤治疗方案。 香港新贝塔公司针对HBOCs 在免疫治疗方面的影响的研究表明，聚合牛源血红蛋白氧载体YQ23 可以通过影响宿主免疫细胞显著抑制肿瘤生长，使免疫检查点PD-L1 下调，炎性细胞因子干扰素γ 和溶细胞颗粒酶B 上调[47]。

HBOCs 增效免疫治疗的可能机制为:1)HBOCs 通过调控HIF-1α 降低降低免疫检查点PD-L1 的表达，增加免疫治疗效果；2)HBOCs 可改善肿瘤组织代谢环境，降低腺苷积累从而调控肿瘤免疫抑制微环境，招募和聚集免疫细胞。

4 总结与展望

血红蛋白类氧载体过去常被用作血液代用品，用以减轻现代输血压力。 随着研究深入，HBOCs 逐渐在多领域发挥作用，包括肿瘤治疗、伤口愈合、器官移植灌注等。 近年来HBOCs 在肿瘤治疗领域发挥作用，研究主要集中在放射治疗、化疗和新型动力学治疗等方面并且已经证实该种增效疗法是安全有效的。 与传统增效放化疗方法相比，将HBOCs 包载成有特殊功能的载体粒子能更好地发挥抗肿瘤效果。 此外，HBOCs 增效免疫治疗研究较少，有待未来深入探讨。

肿瘤部位缺氧激活肿瘤细胞产生系列适应性反应，可能是一些抗肿瘤药物产生耐受性的重要原因之一。 研究缺氧与肿瘤进展之间的关系或许是解决抗肿瘤问题的关键点之一。 HBOCs 作为1 种纳米级高效携释氧剂，在实体瘤内与肿瘤微环境息息相关，HBOCs 可通过红细胞无法通过的紊乱肿瘤血管直接向乏氧肿瘤组织传递氧，从根本上纠正肿瘤乏氧微环境的产生，下调HIF-1α 及系列转录调控因子，从而改善肿瘤免疫抑制微环境，可见HBOCs 在抗肿瘤治疗发展方面的良好的发展前景。 因此，未来研究方向可开发新型血红蛋白类氧载体，或与免疫检查点抑制剂等免疫药物进行联用，探讨HBOCs 在免疫治疗方面的应用，深入研究氧与肿瘤微环境的关系，挖掘HBOCs 增敏免疫治疗的机制。 综上所述，HBOCs 增敏肿瘤治疗有望成为1 种有前景的临床治疗策略。