达雷妥尤单抗治疗患者检出抗-K、抗-Wra的血清学分析

黄娴 赵瑛 李彤彤 杨扬 马蕾 解金辉 种靖慧

(天津市血液中心，天津 300110)

CD38 在多发性骨髓瘤细胞表面高表达，抗CD38 单克隆抗体达雷妥尤靶向作用于CD38，在多发性骨髓瘤治疗中取得明显疗效。 CD38 同时也少量表达于红细胞表面，达雷妥尤单抗可干扰输血相容性检测。 最常用的消除达雷妥尤单抗干扰的方法是使用二硫苏糖醇(DTT) 处理红细胞，其不影响ABO、Rh 及大部分其他系统抗原，但会影响Kell、LW、Yt、Dombrock 等系统的抗原[1]。 我们在1 例使用达雷妥尤单抗的患者血浆内检出抗-K、抗-Wra，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

女，72 岁，有妊娠史，近期多次输血史。 临床诊断为多发性骨髓瘤，2 周前合并肺炎，呼吸道病原体检测为鲍曼不动杆菌阳性。 初次使用达雷妥尤单抗1 周后，医院因抗筛阳性配血困难送至本中心进行抗体鉴定和交叉配血。

1.2 试剂与仪器

抗-A、抗-B(批号:20220712)，反定型细胞(批号:20235339)，抗-C3d(批号:20225202)，抗-(IgG＋C3d)(批号:20225001)，木瓜酶(批号:20230328)，均为上海血液生物试剂。 抗-D(IgM， 批 号:8000453311)， 抗 筛 细 胞(批 号:8000460052，8000460260)、 谱 细 胞(批 号: 8000460054，8000460122，8000460262)，均为Sanquin 公司产品。 抗-K(IgM，批号:OKM215-1)，抗-k(IgG，批号:MkM267-1)，抗-IgG(批号:H0MIgG052-1)均为CE-IMMUNDIAGNOSTIKA 公司产品。 凝聚胺试剂(长春博德，批号:20230703)，二磷酸氯喹(长春博德，批号:20230602)，胰蛋白酶(北京索莱宝，批号:304U043)，低离子抗人球蛋白卡(达亚美，批号:8461299326)。 离心机(KA2200，日本久保田)，水浴箱(SSW-600-2S，上海博迅)，毛细管离心机(1-14，Sigma 公司)。

1.3 方法

1.3.1血型鉴定

ABO、RhD 和K 抗原检测采用试管法。 抗-k 和抗-Wra试剂血清为IgG 类，患者直抗阳性，患者红细胞经二磷酸氯喹充分放散后采用试管抗人球法检测k 和Wra抗原。 Wra抗原和k 抗原分别设置阴性对照和阳性对照，对照细胞选自谱细胞，与患者细胞同时采用二磷酸氯喹方法处理并用试管抗人球法检测，阳性对照2＋，阴性对照无凝集，结果有效。

1.3.2直抗、抗体筛查、抗体鉴定、交叉配血

均按全国临床检验操作规程第4 版操作，0.2 mol/L DTT 处理红细胞、0.01 mol/L DTT 区分IgM 和IgG 抗体、抗体效价步骤参照AABB 技术手册第20 版，毛细管离心按参考文献[2]方法操作。 盐水法均为室温直接离心读取结果。

1.3.3酶处理细胞

按照试剂说明书配制木瓜酶、胰蛋白酶溶液。 木瓜酶处理红细胞:1%木瓜酶与2%～5%红细胞悬液1 ∶1混匀，37℃孵育10 min，3 洗红细胞后配成悬液。 胰蛋白酶处理红细胞:0.5%胰蛋白酶与2%～5%红细胞悬液3 ∶1混匀，37℃孵育20 min，3 洗红细胞后配成悬液。 酶处理红细胞均评估合格，评估步骤参照AABB 技术手册(第20 版)。

2 结果

2.1 血型鉴定

患者血型为O RhD(＋)，K-k＋，Wra-。

2.2 直接抗人球试验

采用卡式抗人球蛋白方法，抗IgG:2＋s，抗C3d:w＋，抗-(IgG＋C3d):2＋s。 患者细胞经毛细管离心后近心端抗-(IgG＋C3d):2＋s，远心端抗-(IgG＋C3d):2＋。

2.3 抗体筛查、抗体鉴定

患者血浆盐水法、凝聚胺法与抗筛3 号K 抗原阳性细胞凝集，卡式抗人球蛋白方法均阳性，见表1。 谱细胞反应结果见表2，盐水法格局为抗-K，凝聚胺法除了抗-K，可能含抗-Wra。 加做不同批号的部分谱细胞，确证为抗-K、抗-Wra。

表1 患者血浆与抗筛细胞反应结果Table 1 Plasma and screening cells reaction results

表2 Sanquin 谱细胞反应结果Table 2 Plasma and panel cells(Sanquin)reaction results

2.4 达雷妥尤单抗影响分析

采用卡式抗人球蛋白方法，患者血浆与未处理的抗筛细胞反应均为2＋w～2＋，与0.2 mol/L DTT 处理后的抗筛细胞不凝集，与胰蛋白酶处理后的抗筛细胞不凝集，与木瓜酶处理后的抗筛细胞反应均为3＋(表1)。 该患者1 周前使用达雷妥尤单抗，0.2 mol/L DTT 或胰蛋白酶处理细胞，可消除达雷妥尤单抗对抗筛的干扰，而木瓜蛋白酶不能。 患者自身细胞酸放散液与抗筛细胞均阳性2＋w～2＋，与0.2 mol/L DTT 处理后的抗筛细胞不凝集，与胰蛋白酶处理后的抗筛细胞不凝集，放散液抗体应为达雷妥尤单抗。

2.5 DTT、酶处理对K 抗原的影响

抗筛3 号K 抗原阳性细胞经0.2 mol/L DTT 处理后，与抗-K 试剂血清不凝集；该细胞经胰蛋白酶或木瓜酶处理后，与抗-K 试剂血清凝集，强度与处理前相同均为3 ＋。 0.2 mol/L DTT 处理红细胞可破坏K 抗原，而胰蛋白酶和木瓜酶不会破坏。

2.6 DTT、酶处理对达雷妥尤单抗治疗患者IgG 抗-k 的检测效果

由于患者血样量的限制，使用76 d 后送检的患者血清，此血清中的抗-K、抗-Wra已测不出，患者持续使用达雷妥尤单抗，仍干扰间接抗人球蛋白试验。 患者血清与IgG 抗-k试剂血清按4 ∶1比例混合，加抗-k 前后检测结果见表3。 再次证明DTT、胰蛋白酶处理可排除达雷妥尤单抗干扰，而木瓜酶不能。 DTT 处理漏检IgG 抗-k，而胰蛋白酶处理可检出IgG 抗-k。

表3 DTT、酶处理对达雷妥尤单抗治疗患者IgG 抗-k 的检测Table 3 DTT / enzyme treatment for the detection of IgG anti-k in patient treated with daratumumab

2.7 抗体性质

未处理的患者血浆与抗筛3 号K 抗原阳性细胞在盐水介质凝集，0.01 mol/L DTT 处理患者血浆的IgM 抗体后，盐水法与抗筛3 号细胞不凝集，卡式抗人球蛋白方法与胰蛋白酶处理后的抗筛3 号细胞不凝集，抗-K 为IgM 类。 患者血浆与谱细胞16 号Wra抗原阳性细胞反应，盐水法阴性，凝聚胺法凝集1＋，胰蛋白酶处理细胞后卡式抗人球蛋白方法凝集2＋。 0.01 mol/L DTT 处理患者血浆的IgM 抗体后，与胰蛋白酶处理后的16 号谱细胞卡式抗人球蛋白方法凝集1＋，抗-Wra为IgG 类。 取O 型、K-k＋红细胞与患者血清4℃吸收，56℃热放散，放散液与K＋k-细胞不凝集。 本例抗-K不属于类自身抗体，为同种抗体。

2.8 抗体效价及持续检测

使用K＋k-细胞，抗-K 盐水法效价4，凝聚胺法效价8。使用Wra＋细胞，抗-Wra凝聚胺法效价2，胰蛋白酶处理细胞后卡式抗人球蛋白方法效价4。 持续检测之后该患者历次送检血浆的效价，抗-K 盐水法: 11 d 后效价4， 23 d 后效价2，32 d 后效价1。 39 d 后，盐水法室温直接离心不凝集，4℃15 min 恢复室温后与K＋k-细胞凝集，强度1＋，76 d 后测不出抗-K。 抗-Wra凝聚胺法:11 d 后效价2，23 d 后效价2，32 d 后效价1，39 d 后效价1，76 d 后测不出抗-Wra。

2.9 交叉配血

选择O 型，K-k＋，Wra-的悬浮红细胞2 U 与患者配血，盐水法、凝聚胺法主次侧均阴性，卡式抗人球蛋白方法主次侧均2＋，0.2M DTT 处理献血者红细胞后卡式抗人球蛋白方法主侧为阴性。 患者输注效果良好，无输血不良反应。 之后继续此输血策略，临床反馈安全有效。

3 讨论

Kell 血型是抗人球蛋白方法检出的第1 个血型抗体，白种人K 抗原阳性约为9%[3]，抗-K 是白种人群中除ABO 和Rh 系统以外最常见的抗体，可导致急性和迟发性溶血性输血反应和胎儿新生儿溶血病。 抗-K 通常是IgG 抗体，多为IgG1，常对低离子强度溶液不敏感，凝聚胺法或低离子介质的抗人球蛋白法有漏检的可能。 抗-K 的产生主要分为3种:1)大多数因怀孕或输血免疫刺激产生；2)少量病例在自身抗体的患者血清中检出类自身抗-K[4]；3)少量病例疑似微生物感染所致。 Marsh 等[5]报道1 例无输血史的新生儿患菌痢，检出IgM 抗-K，其母亲血清内未检出，2 个多月后患儿康复，抗-K 也未再检测出。 Kanel 等[6]报道1 例无免疫史的肺结核患者产生IgM 抗-K，可能与结核分枝杆菌有关。细菌感染导致的K 免疫还可能与摩氏摩根菌相关，而摩氏摩根菌感染者的抗-K 可能由IgA 类转化而来[7]。

中国汉族人群K 抗原频率极低，约为0.07%，抗-K 罕见，万方和知网数据库文献共7 例报道[8-14]，多为IgG 类，2例为IgM 和IgG 混合抗体，国内尚未见仅IgM 抗-K 报道。庄光艳等[11]发现1 例无输血史的男性患者，临床诊断为慢性肾功能不全，使用盐水法和卡式抗人球蛋白方法检出IgM和IgG 混合抗-K。 李小飞等[12]在1 例产妇血清中检出IgM和IgG 混合抗-K，在盐水法、凝聚胺法、卡式抗人球蛋白方法均有凝集，导致新生儿溶血病。 本文患者有多次输血史，但患者红细胞与抗-K 试剂反应阴性，未出现混合视野凝集，患者红细胞经毛细管离心，近心端和远心端直抗凝集强度差异不大，均提示近期未输注K 抗原阳性的血液。 如有条件，应检测患者历次输注血液的K 抗原以排除免疫因素。 吸收放散试验和患者自身细胞放散液的结果显示本例抗-K 为同种抗体，而非自身抗体。 本例患者确诊为多发性骨髓瘤同时感染肺炎，革兰氏阴性的鲍曼不动杆菌阳性，抗-K 为IgM类，产生原因不排除与细菌感染相关。

抗-Wra属于Diego 系统的抗体，相对常见，大多为联合其他同种抗体尤其是自身抗体时发现[15]。 抗-Wra由天然或免疫介导产生，为IgG、IgM 或两者都有，部分抗-Wra是盐水介质抗体，大多数由抗人球蛋白试验检出[4]。 Wra抗原为低频抗原，抗原分布＜0.01%[16]，有地区差异，温机智等[17]发现广州地区Wra抗原频率为1 /1 000，褚晓月等[18]研究陕西地区Wra抗原分布频率为1 /7 490。 本例抗-Wra为IgG，可由抗人球蛋白试验检出。 由于K 和Wra抗原阳性率极低，交叉配血基本可盲配。

CD38 分子是兼具受体及外切酶活性的Ⅱ型跨膜糖蛋白，参与细胞黏附与跨膜信号传导过程，达雷妥尤单抗是1种人源化、抗CD38 IgG1 单克隆抗体。 治疗多发性骨髓瘤的同时，达雷妥尤单抗与红细胞表面的CD38 抗原结合，引起间接抗球蛋白试验全凝集，通常1＋～2＋，干扰相容性检测，停止使用达雷妥尤单抗后，其对间抗的影响可能会持续2 ～6 个月。 目前克服CD38 单抗对输血相容性检测干扰的方法主要有[19]:1)DTT 处理红细胞，是目前国际上消除CD38单抗干扰最常用的方法，DTT 裂解CD38 分子胞外区的二硫键，使CD38 抗原变性，阻止其与CD38 单抗结合。 但DTT也会使Kell 系统等抗原变性，故当高加索人种患者使用CD38 单抗后有输血需求时，推荐做Kell 同型输注。 我国人群基本都为K-k＋型，但本试验提示使用DTT 处理红细胞可漏检Kell 系统IgG 抗体。 2)凝聚胺试验该方法简单快速，但同样对Kell 系统的抗体检测缺乏足够的灵敏度。 CD38分子在胞外带负电荷的羧基，在低离子环境下极易与凝聚胺分子结合，进而可以干扰红细胞表面CD38 分子与达雷妥尤单抗的结合[20]。 本例患者血清中的抗-K 在凝聚胺介质仍可与K 抗原阳性细胞发生凝集，与之前报道的某些IgM抗-K 类似。 3)其它目前使用较少的方法，包括蛋白水解酶法、红细胞表型分型和基因型分型、中和蛋白试验。 其中蛋白水解酶法的研究包括胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。 本实验检测了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶对去除达雷妥尤单抗干扰的效果，患者血浆和自身细胞放散液的结果均证明胰蛋白酶有效。 在检测实验室数例其他患者血清时，也发现胰蛋白酶可消除达雷妥尤单抗的干扰。 胰蛋白酶可以切割CD38 的表位和酶活位点而不会降解Kell 系统抗原。 但是胰蛋白酶会影响很多其他抗原，如M，N，EnaTS， Ge2，Ge3，Ge4，Ch /Rg，Duffy 和Lutheran 等[19]，造成常见抗体的漏检。 胰蛋白酶还可能引起非特异性凝集，它去除CD38 单抗干扰的效果还需更多实验研究。 目前去除CD38 单抗干扰的常用方法是DTT 处理细胞和凝聚胺试验，若怀疑掩盖同种抗体，比如Kell 系统的抗体时，胰蛋白酶处理细胞可提供思路和参考。