基于网络药理学和分子对接探讨银柴胡抗痛风作用机制*

李文静 潘 旭 刘 军△ 朱 慧

痛风是因单钠尿酸盐沉积于关节及周围组织引起以反复发作炎症为主的反应性关节病,发病主要与嘌呤代谢紊乱、肾脏尿酸排泄障碍所引发的高尿酸血症相关,严重者可致关节破坏、变形[1]。目前,临床治疗痛风的药物主要有非甾体抗炎药、秋水仙碱、抑制尿酸生成药、促尿酸排泄药等[2]。长期服用会产生胃肠道反应、肝肾毒性等不良作用[3]。中草药因具有成本低、安全性高、不良作用小的优势,已成为治疗痛风的研究热点。

银柴胡是宁夏道地优势中药材,以根入药,归肝经、胃经,具有清虚热、除疳积、清热凉血之功[4]。临床常用于治疗小儿疳积发热、阴虚潮热、感冒高热、腹大肢瘦等疾病[5]。西医疾病多体现在代谢及免疫学疾病:如痛风、强直性脊柱炎等。痛风属于中医“痹证”范畴,《本草求原》曰:“清肺、胃、脾、肾热,兼能凉血。治五脏虚损,肌肤劳热,骨蒸烦痛,湿痹拘挛”,但其发挥药效的物质基础和作用机制尚不明确[6]。因此,本研究通过网络药理学及分子对接探讨银柴胡抗痛风的作用机制,为临床应用及后续实验验证提供一定基础。

1 材料与方法

1.1 银柴胡活性成分收集TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库中检索银柴胡中的化学成分,利用口服生物利用度(OB)≥30%、药物相似性(DL)≥0.18作为筛选条件,筛选出高度活性的有效成分。

1.2 成分作用靶点的获取在TCMSP数据库中收集银柴胡的有效成分,PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search)[7]搜索相应主要成分的SMILE name。将其导入SwissTargetPrediction 数据库中,预测银柴胡有效成分对应的潜在靶点。

1.3 痛风相关靶点DisGenet(https://www.disgenet.org)、Genecards(https://www.genecards.org)[8]等数据库检索与“GOUT”相关的作用靶点,将所得靶点去除重复项后得到痛风相关靶点。

1.4 药物-疾病交集基因获取分别将银柴胡活性成分的相关靶点与疾病相关靶点,输入微生信(www.bioinformatics.com.cn)“2～6个数据集VENN图”绘制交互式venn图,筛选两者交集基因。

1.5 构建蛋白相互作用网络(PPI)将收“药物-疾病”共有基因导入String平台(Https://string-db.org/),选择Homo spaiens,Confidences为0.7,其余参数保持默认,构建 PPI。将PPI网络模型前20导入Cytoscape 3.9.1软件,运用“Net work analysis”功能,筛选出关键靶点基因,构建网络图。

1.6 GO功能及KECC通路富集分析将共同靶基因导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行Go(Gene Ontology) 富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedida of Genes and Ge-nomes)分析,物种选择Homo spaiens,以Pvalue<0.01,count≥5为参考值,分别筛选收集BP(生物过程)、CC(细胞过程)、MF(分子功能)条目、KEGG通路并进导入微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/),进行相应GO富集气泡图制作及可视化分析。

1.7 成分-靶标-通路-疾病网络构建将筛选的活性化合物、靶点及 Pvalue<0.01且Count≥5主要信号通路导入构建Cytoscape软件对可视化网络构建及分析。

1.8 分子对接依据1.4及1.6得到的主要有效成分及核心靶点进行分子对接,应用TCMSP得到有效成分的Pubmed编号,从Pubchem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.n-ih.gov/)中下载有效成分的3D结构,作为配体。从 PDB 数据库(https://www.rcsb.-org/)中下载靶基因的 3D 结构,作为受体;当自由结合能≤5 kJ·mol-1时,表明受体和配体对接良好,数值越小表明结合能力越好[10],Pymol 软件自由能较低的组别进行结果制图可视化呈现。

2 结果

2.1 银柴胡活性成分及药物靶点的筛选结果共筛选得到11个活性化合物,以Probability*>0为筛选条件,获得265个靶基因。见表1。

表1 银柴胡的化学成分信息(OB≥30%,DL≥0.18)

2.2 痛风相关靶点获取以“Gout”为关键词分别从 DisGenet(Score≥0.3)、Genecards(Relevance score>0.5)检索痛风相关靶点,去除重复值,共1128个。

2.3 药物-疾病交集基因获取将银柴胡活性成分相关的265个靶点与痛风1128个靶点进行Venn分析,得到交集基因50个。见图1。

图1 交集基因Venn图

2.4 PPI网络的构建PPI图共涉及21个蛋白,52条相互作用关系。将前20导入Cytoscape 3.9.1软件进行网络拓扑分析,选取 Degree、Closeness、Eigenvector和 Betweeness 都大于中位的靶点,得到8个核心靶点基因,分别为SRC、TNF、ALB、PPARA、NOS2、CASP1、PPARG。见图2、图3。

图2 银柴胡抗痛风PPI网络图

图3 银柴胡抗痛风关键靶点基因拓扑图

2.5 GO功能分析及 KEGG 信号通路分析按照Pvalue<0.01[9],共得到178个信号通路。以Pvalue<0.01,count≥5为参考值,筛选收集BP(生物过程)条目18个,主要包括ERK1和 ERK2级联的正向调节、细胞内受体信号通路、细胞对脂多糖的反应、肽基-酪氨酸磷酸化、肽基-酪氨酸磷酸化的正向调节等;CC(细胞过程)条目16个,包括受体复合物、膜筏、核质、质膜、细胞质等;MF(分子功能)条目15个,包括RNA聚合酶II转录因子活性,配体激活的序列特异性DNA结合等。见图4～图6。KEGG通路条目11个,主要涉及癌症的通路、化学致癌-受体活化、脂质和动脉粥样硬化、结核、PPAR信号通路等。见图7。

图5 GO-CC气泡图

图6 GO-MF富集气泡图

图7 KEGG通路富集气泡图

2.6 药物-活性成分-靶点-通路网络的构建与分析共10种活性化合物作用于上述11种信号通路,其中Degree值较高的为银柴胡胺D、(2R)-5,7-二羟基-黄烷酮、豆甾醇、菠菜甾醇、谷甾醇等通过作用在癌症的通路(HSA05200)、化学致癌-受体活化(HSA05207)、脂质和动脉粥样硬化(HSA05417)等通路信号上的SRC、PPARG、TNF、PPARA、ALB、PRKCA等蛋白相互作用而发挥抗痛风作用。见图8。

图8 药物活性成分-靶点-疾病-通路图

2.7 分子对接结果结合1.4及1.6得到结果,选取通路信号最多的SRC、TNF、PPARG、PPARA、ALB、PPKCA、PPARD、NOS2等关键靶基因分别与银柴胡胺D、(2R)-5,7-二羟基-黄烷酮、豆甾醇、菠菜甾醇、谷甾醇进行分子对接,结合活性良好(-14.06～-29.46 kJ·mol-1);排名前2名的可视化图见图9。

图9 银柴胡活性成分与核心靶点分子对接构象图

3 讨论

痛风属于中医“痹证”范畴。中医认为寒、湿等邪气为主要病因,病位在经脉,若走注关节,痛热甚剧。按照中医治法,若痹证热邪偏胜者,清热为主[11]。现代研究证实,炎性细胞和细胞因子之间的相互作用与该病的发病有密切关系,当发生痛风时,血液尿酸浓度升高,尿酸盐结晶容易析出,对血管内膜造成慢性炎性损害,损伤的动脉内有大量的单核细胞黏附于内膜上,促进IL-6、TNF等释放[12]。本研究共筛选出银柴胡有效活性化合物11个,拓扑图显示其中植物甾醇类为抗痛风发挥主导作用。其中谷甾醇可通过抑制炎症小体的核心蛋白 NLRP3 的表达,减少细胞中的促炎细胞因子生成,从而起到抗炎、抗痛风的作用。豆甾醇显著降低炎症因子IL-1β、IL-6、MCP-1 和环氧合酶 COX-2的mRNA表达,与炎性反应联系密切[13]。α-菠甾醇具有抗炎和解热的作用[14]。

本研究共预测获得银柴胡抗痛风8个核心靶点,包括:SRC、TNF、ALB、PPARA、PPARG、NOS2、CASP1、APP。SRC编码的原癌基因酪氨酸蛋白激酶可调节细胞代谢、存活和增殖[15],能够与PTK2B/PYK2一起在破骨细胞骨吸收中发挥重要作用,还可通过激活线粒体细胞色素C氧化酶促进破骨细胞的能量产生[16]。PPARG能抑制炎性细胞因子如 NF-κB、TNF-α、C反应蛋白的产生和活化[17]。ALB可在组织损伤或炎症引起的白蛋白分解代谢增加,增强免疫作用[18]。NOS2能够促进一氧化氮(NO)合成,过量的NO直接引起细胞毒副作用,对细胞造成损害,从而促进炎症性疾病-痛风的发生[19]。排名前10的信号通路为癌症通路、化学致癌-受体活化、脂质和动脉粥样硬化、PPAR信号通路等。其中PPAR信号通路是发挥调血脂作用的一条重要途径,PPAR 信号通路上的蛋白如PPARA、PPRRγ 等能够影响脂肪吸收、脂肪代谢等一系列的代谢相关重要环节[20]。PPARG通过抑制NF-KB介导的促炎症反应使部分组织细胞受细胞因子或炎性介质的刺激下,表达上调[21]。TNF-α 为体内与炎症反应相关的细胞因子,其产生途径与多种蛋白产生的级联效应有关[22]。故银柴胡抗痛风具有多成分、多靶点、多通路的特点。

分子对接验证银柴胡活性成分与关键靶点 SRC、TNF、ALB、PPARA、PPARG、PPARD、PRACA等之间结合能力,发现银柴胡胺D、(2R)-5,7-二羟基-黄烷酮、豆甾醇、菠菜甾醇、谷甾醇与8种蛋白均具有良好的结合活性,初步验证银柴胡多种有效成分通过作用于关键靶点起到抗痛风的作用,为后续进一步实验验证及临床应用奠定基础。