沉默TUFM通过AMPK/mTOR信号通路调控线粒体自噬对肺源性心脏病模型大鼠肺动脉高压的影响

崔本科,王岩,卢云凤,杜鹃,翟羽涵

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一种恶性心血管疾病,以肺血管床阻塞性重构和进行性阻力增加为特征,最终导致右心功能障碍[1]。目前针对PAH发病机制的研究主要集中在肺血管平滑肌细胞,但由于其调控通路中信号分子的复杂性,其机制仍不清楚。最近的研究证实,线粒体通过感知缺氧、氧化应激和凋亡在PAH发病中发挥重要作用[2],提示线粒体代谢可能是PAH的关键调节因素。线粒体自噬作为线粒体质量控制的必要手段,可选择性地清除受损线粒体碎片,防止线粒体和细胞功能障碍[3]。报道称线粒体自噬的激活导致肺动脉平滑肌细胞过度增殖,增加肺血管阻力[4],但其调控PAH的确切分子机制尚未可知。线粒体翻译延伸因子Tu(mitochondrial translation elongation factor Tu,TUFM)部分位于线粒体外膜上,与蛋白质翻译延伸合成、氧化磷酸化和蛋白质控有关[5]。其表达异常可通过引起线粒体呼吸链失衡和/或促进电子泄露,导致活性氧产生,影响细胞稳态[6]。最近的PAH模型大鼠线粒体蛋白质组分析鉴定了TUFM的差异表达[7],但关于TUFM在PAH进展中的生物学作用知之甚少。因此,本研究旨在揭示TUFM对PAH发生发展的影响,并探讨其可能的调控机制,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与动物

1.1.1 实验动物:36只健康雄性Sprague-Dawley大鼠(200～220 g,4～5周龄),由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可证号:SCXK(京)2021-0004。所有大鼠均饲养于辽宁省人民医院动物实验中心,标准饲养条件,自由饮食,适应1周后进行实验。

1.1.2 试剂耗材:大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)购自北京中科质检生物技术有限公司;野百合碱(MCT,货号C2401,美国Sigma-Aldrich);蛋白定量检测试剂盒(货号:14G30C40,武汉博士德公司);苏木素—伊红(HE)染色试剂盒(货号:G1120,北京索莱宝公司);TUFM、CD31、Bcl2相关X蛋白(Bax)抗体(货号:ab173300、ab222783、ab182734,美国Abcam公司);α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(货号:BM0002,美国BOSTER公司);人微管相关蛋白轻链3(LC3)、苄氯素1重组蛋白(BECN1)、P62、凋亡酶激活因子(Apaf)、β肌动蛋白(β-actin)抗体(货号:3868、3495、39749、8723、4970,美国CST公司);B淋巴细胞瘤2(Bcl2)抗体(货号:ET1702-53,美国HUABIO公司);磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化(p)-AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR抗体(货号:bs-5551R、bs-2771R、bs3494R、bs3495R);细胞计数(CCK-8)检测试剂盒(货号:HY-K0301,美国MCE公司)。

1.1.3 主要实验仪器:脉冲多普勒仪(Vevo 2100,Visualsonics公司);透射电子显微镜(HT 7700,日本HITACHI公司);Cytation3多功能酶标仪(美国BioTek公司);Chemi Doc XRS化学发光凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司);160HR高速冷冻离心机(美国赛默飞公司);倒置式生物显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 实验方法 2022年1月—2023年6月于辽宁省人民医院中心实验室进行实验。

1.2.1 PAH实验动物模型构建及分组:将36只大鼠随机分成6组:空白对照(Ctrl)组,模型(PAH)组,TUFM过表达(OE)组,OE阴性对照(OE-NC)组,短发夹RNA(Sh)敲除TUFM(Sh)组和Sh阴性对照(Sh-NC)组,每组6只。Ctrl组仅给予等量生理盐水,其余5组根据文献[8],将溶解于0.5 mmol/L盐酸(pH=7.4)溶液的1% MCT(60 mg/kg)一次性腹腔注射诱导肺源性心脏病大鼠模型。基于美国国家生物技术信息中心相关序列(NM_001106295.1),选择具有平滑肌22α(SM22a)基因的血清型腺相关病毒(AAV9)作为平滑肌特异性启动子。对于OE和Sh组,在给予MCT的同时将1 ml含有1012GC/ml滴度的敲低或过表达的AAV9分别注射到大鼠尾静脉中,OE-NC组和Sh-NC组使用等体积的相应空溶剂作为阴性对照,4周后进行后续实验。序列如下:Sh-TUFM:上游,5′-CCCUGGUCAUGCAGAUUAUTT-3′和下游,5′-AUAAUCUGCAUGACCAGGGTT-3′和Sh-NC:上游,5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,下游,5′-ACGUGACACGU-UCGGAGAATT-3′。

1.2.2 细胞模型制备及分组处理:PASMC聚集至80%～90%时,更换为无血清改良Eagle培养基,置于37℃培养箱内饥饿处理24 h,更换常规培养基,随机分为常氧(Norm)组、低氧(Hyp)组、小干扰RNA(SiRNA)-1组、SiRNA-2组、Si-NC组、OE-NC组和OE组。Norm组和Hyp组分别置于常氧(21%O2, 5%CO2,74%N2,37℃)和低氧(3%O2,5%CO2,92%N2,37℃)培养箱中培养24 h;Si-NC组、SiRNA-1组、SiRNA-2组、OE-NC组和OE组细胞分别转染携带Si-NC、Si-TUFM-1组、Si-TUFM-2、OE-NC和OE-TUFM质粒,孵育6 h后,放入低氧培养箱中培养24 h。序列如下,Si-TUFM-1:上游,5′-CACCGAGUUUGGCUAUAAATT-3′和下游,5′-UUUAUAGCCAAACUCGGUGTT-3′; Si-TUFM-2:上游,5′-GGGCUAAGUUCAAGAAGUATT-3′和下游,5′-UACUUCUUGAACUUAGCCCTT-3′; Si-NC:上游,5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,下游:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.3 血流动力学测定和组织收集:各组大鼠使用2.5%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉并固定在工作台上。脉冲多普勒检测肺动脉多普勒信号,并测量肺动脉加速时间(PAAT)。每次测量重复3次,计算平均值。使用颈静脉右心导管插管直接检测血流动力学数据:经颈行正中切口,钝性分离右颈外静脉,将3F聚乙烯导管插入主肺动脉,参照文献[9]方法测量肺动脉压力。用生理盐水冲洗右肺和右心组织以清除血液,液氮冷冻,-80℃保存。左肺用4%多聚甲醛固定,石蜡切片行组织学检查。

1.2.4 大鼠肺小动脉形态学检测:根据HE染色试剂盒说明书,石蜡切片行HE染色,光学显微镜下观察肺内小动脉病理情况。在低倍视野下随机选取外径(ED)50～200 μm的血管,分析血管内径肥大情况。测量ED和中膜厚度(MT),并按照文献[10]根据MT百分比(MT%=2×MT/ED×100%)计算动脉重塑。

1.2.5 免疫荧光共染色检测TUFM定位:石蜡切片用过氧化氢处理后,5%牛血清白蛋白封闭,然后分别与TUFM、α-SMA或CD 31单克隆抗体在4°C下孵育过夜。洗涤未结合的一抗后,滴加异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG、Cy3标记的羊抗兔IgG二抗在37°C下孵育30 min。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木精复染并封片,荧光显微镜下观察拍照记录。

1.2.6 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TUFM、自噬、凋亡和AMPK/mTOR相关蛋白表达:将收集的肺组织和PASMC细胞加入含有苯甲磺酰氟和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解缓冲液,冰上裂解30 min。二喹啉甲酸法测定蛋白浓度,等量的蛋白通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜后将聚偏二氟乙烯膜用5%脱脂牛奶封闭2 h,分别加入TUFM、LC3、BECN1、P62、Bax、Bcl2、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR(抗体稀释倍数1∶1 000)和β-actin(1∶10 000),4℃孵育过夜。次日,将膜与含有辣根过氧化物酶的二抗在室温下孵育1 h。洗涤后,使用增强化学发光法对条带显影,以β-actin作为内参,Image J软件进行灰度值测定分析。

1.2.7 CCK-8法检测细胞增殖活力:根据说明书使用CCK-8试剂盒检测细胞活力。用上述不同条件处理细胞,然后胰蛋白酶消化并均匀接种到96孔板中。每孔加入100 μl CCK-8混合液,37°C下孵育2 h。分别在12、24和36 h利用酶标仪测量450 nm处吸光度。

1.2.8 透射电镜检测细胞线粒体结构:将PASMC细胞按照上述方式处理24 h后,戊二醛固定,用PBS洗涤3次。然后用1%锇酸处理,再次用PBS冲洗,并用丙醇脱水。将细胞包埋在环氧树脂和2%醋酸铀-饱和乙醇溶液中。通过透射电子显微镜观察不同处理组的线粒体结构和自噬小体。

2 结 果

2.1 PAH模型大鼠肺动脉TUFM表达水平及定位 Western blot结果显示,与Ctrl组比较,PAH组大鼠肺动脉TUFM蛋白表达显著升高(P<0.05,图1A、B)。荧光共染结果显示,绿色荧光标记的TUFM与红色荧光标记的PASMC标志物α-SMA在肺小动脉内膜重合为黄色荧光,存在共定位;而TUFM与内皮细胞标志物CD31未见明显重合和共定位(图1C)。

注:A.Western blot检测PAH大鼠肺动脉TUFM蛋白表达;B.灰度值统计图;C.免疫荧光检测TUFM定位(×200)。Marker.目的蛋白;TUFM.线粒体翻译延伸因子TU;DAPI.4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚;Merge.合并。与Ctrl组比较,*P<0.05,**P<0.01。

2.2 TUFM对PAH大鼠血流动力学的影响 与Ctrl组比较,PAH组肺动脉收缩压(PASP)升高,PAAT缩短(P<0.05);与PAH组比较,OE组PASP显著升高,PAAT明显缩短(P<0.01);与PAH组比较,Sh组PASP降低,PAAT延长(P<0.05),见图2。

注:A. 颈静脉右心导管插管检测PASP;B.脉冲多普勒超声检测PAAT。与Ctrl组比较,*P<0.05,**P<0.01;与PAH组比较,#P<0.05,##P<0.01。

2.3 TUFM对PAH大鼠肺动脉重构的影响 HE染色结果显示,与Ctrl组比较,PAH组大鼠远端肺小动脉管壁呈向心性增厚,管腔狭窄几乎堵塞,MT百分比显著升高(P<0.05);与PAH组比较,Sh组肺小动脉管壁厚度和管腔狭窄度有所改善;OE组肺小动脉管壁厚度明显高于PAH组(P<0.05),见图3。

注:与Ctrl组比较,*P<0.05,**P<0.01;与PAH组比较,#P<0.05。

2.4 TUFM对PAH大鼠线粒体自噬和细胞凋亡相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示,与Ctrl组比较,PAH组大鼠肺动脉TUFM、BECN1、LC3II/I和Bcl2蛋白表达升高,P62、Bax和Apaf蛋白表达降低(P<0.05);与PAH组比较,OE组肺动脉TUFM、BECN1、LC3II/I和Bcl2表达显著升高,P62、Bax和Apaf表达明显降低(P<0.05),Sh组TUFM、BECN1、LC3II/I和Bcl2表达降低,P62、Bax和Apaf表达升高(P<0.01),见图4。

注:与Ctrl组比较,*P<0.05,**P<0.01;与PAH组比较,#P<0.05,##P<0.01。

2.5 缺氧对PASMC细胞TUFM蛋白表达的影响 与Norm组比较,Hyp组细胞缺氧刺激可上调TUFM表达(P<0.01),见图5。

注:**P<0.01。

2.6 缺氧对PASMC细胞线粒体自噬和凋亡相关蛋白表达的影响 与Si-NC组比较,SiRNA-1和SiRNA-2组细胞P62和Bax蛋白表达升高,BECN1、LC3II/I、Bcl2和TUFM表达降低(P<0.05);与OE-NC组比较,OE组细胞P62和Bax蛋白表达降低,BECN1、LC3II/I、Bcl2和TUFM表达升高(P<0.05),见图6。

2.7 缺氧对PASMC细胞线粒体结构的影响 透射电镜发现,Si-NC组和OE-NC组在缺氧条件下线粒体轻微肿胀,但膜仍完整;部分损伤的线粒体嵴减少,损伤线粒体包裹在自噬体中。SiRNA-1和SiRNA-2组细胞线粒体结构完整,嵴存在,膜完整,仅有少量自噬溶酶体。OE组可见部分线粒体损伤崩解,嵴断裂消失,以及一些含有受损线粒体片段的自噬小体,见图7。

图7 透射电镜检测缺氧对PASMC细胞线粒体结构的影响(×8 000,箭头代表自噬小体)

2.8 TUFM对缺氧诱导PASMC细胞增殖活性的影响 CCK-8法检测结果显示，与Si-NC组比较,SiRNA-1和SiRNA-2组细胞增殖活性显著降低(P<0.05);与OE-NC组比较,OE组细胞增殖活性明显升高(P<0.01),见图8。

注:与Si-NC组比较,*P<0.05,**P<0.01;与OE-NC组比较,#P<0.05。

2.9 TUFM对缺氧诱导PASMC细胞AMPK/mTOR通路相关蛋白表达的影响 与Si-NC组比较,SiRNA-1和SiRNA-2组细胞p-AMPK表达降低,p-mTOR表达升高(P<0.05);与OE-NC组比较,OE组细胞p-AMPK表达升高,p-mTOR表达降低(P<0.05),见图9。

注:*P<0.05,**P<0.01。

3 讨 论

PAH是一种进行性致死疾病,以肺小动脉重塑导致肺动脉阻力增加为特征,最终发展为右心功能障碍或右心衰竭。PAH发病机制复杂,涉及遗传、缺氧、氧化应激、糖代谢失衡等多方面因素,其病理主要包括PASMC过度增殖和/或抑制凋亡以及胶原和弹性蛋白等细胞外基质的积累。但由于其分子机制不完全清楚,临床缺乏有效治疗药物,预后仍然较差。因此,迫切需要探索能有效抑制PASMC增殖并改善肺动脉重塑的靶向药物和内在机制。

线粒体作为细胞稳态的中心监护者,协调多种细胞生物过程,如细胞周期进程、线粒体动力学和细胞代谢等,与PAH的发病机制和病理过程密切相关[11]。TUFM是线粒体DNA翻译表达的重要因子,在线粒体功能调控中起关键作用。既往研究显示,TUFM可控制线粒体DNA编码肽的氨基酸延伸,并且其水平的变化能够影响多种细胞生物活性[6, 12-13]。最近的PAH肺动脉蛋白质组学研究发现,PAH与正常个体之间存在TUFM差异表达[7]。因此,结合PAH的发病机制以及TUFM与线粒体功能的关系,推测TUFM可能参与PAH的发生发展。本研究在MCT诱导PAH大鼠模型中发现,与空白对照组相比,PAH大鼠和细胞模型中TUFM表达明显增加,且主要定位于肺小动脉中膜平滑肌细胞,而不聚集于内层内皮细胞,与PAH主要病变细胞相一致[14]，这提示低氧诱导的PAH发生发展过程中TUFM可能起到一定程度的作用,但其中机制尚不明确。

为了探索TUFM是否参与PAH的发展及其在病理过程中的作用,本研究引入TUFM敲低或过表达质粒的AAV9腺相关病毒,构建MCT处理的TUFM沉默或过表达大鼠模型。4周后,TUFM的缺失抑制了PAH的发展,改善PAH小鼠血流动力学情况和肺小动脉血管重构,而过表达TUFM则加重PAH病理结构损伤。此外,与自噬呈负相关的自噬底物P62在Sh组中的表达水平高于PAH组,表明在无TUFM的情况下肺动脉线粒体自噬减少。自噬产物LC3II/I和BECN1水平降低也显示了Sh组线粒体自噬减少。据报道,PAH的发生与PASMC的自噬激活、过度增殖和凋亡抵抗密切相关[14],存在自噬/凋亡互反馈调节机制,逆转自噬/凋亡失衡可有效改善血管重构,从而降低肺动脉压。研究发现,BECN1/Bcl-2在调控自噬/凋亡平衡中发挥关键调控作用[15]。另外,本研究发现TUFM沉默促进PASMC细胞增殖的同时,引起抗凋亡基因Bcl-2表达下调,而凋亡促进因子Bax和Apaf表达上调,反之亦然。因此,TUFM的缺失减轻了体内PAH的发展,这可能归因于线粒体自噬和凋亡调节。

为了探讨TUFM基因沉默抑制线粒体自噬和增殖/凋亡的分子机制,笔者重点研究了已知的信号分子AMPK和mTOR来阐明可能的途径。据报道,AMPK和mTOR通过调控自噬激活激酶1(ULK1)调节自噬,Lin等[16]报道,双酚A可通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路激活促进卵巢颗粒细胞自噬。Gui等[17]发现,红景天苷通过AMPK/mTOR/ULK1通路上调细胞自噬,减轻低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡抵抗。本研究结果发现,AMPK和mTOR的总蛋白水平不受TUFM水平的影响,但p-AMPK和p-mTOR的磷酸化激活受TUFM表达的调节。这说明AMPK和mTOR的活性在一定程度上受TUFM调控。此外,线粒体自噬标志物P62、BECN1和LC3II/I均受TUFM和p-AMPK/p-mTOR的调节。既往研究提示,AMPK通过磷酸化其Ser-555和Ser-777位点来刺激ULK1,而mTOR通过磷酸化ULK1中的不同Ser残基(Ser-757)来抑制自噬[18]。而且mTOR抑制剂和/或AMPK激活剂预处理内质网应激可扩大自噬的“生存窗口”。 这些研究表明,AMPK/mTOR通路在线粒体自噬中起枢纽作用,并调节线粒体功能和稳态。最近有学者提出,AMPK/mTOR诱导的线粒体自噬增强通过控制一些蛋白的浓缩和溶解来调节编码关键线粒体蛋白的核mRNA[19]。而且,TUFM是AMPK和mTOR的上游分子,这一点通过敲低或过表达的状态得到证实。这些结果提示,TUFM通过参与线粒体蛋白的合成,影响线粒体功能和稳态,进而调节整个细胞的功能。

本研究也存在一些局限性,首先,尽管缺氧可以部分模拟PAH的体内环境,但它并不完全代表MCT诱导PAH的发病机制,TUFM研究需要一种模拟PAH的良好体外刺激。其次,遗憾的是没有使用AMPK或mTOR的干扰剂来进一步证实信号通路。鉴于线粒体功能调控在细胞周期过程中的重要性和复杂性,下一步的研究将从线粒体的功能和代谢调控两个方面来探讨PAH的发生机制。

综上所述,抑制TUFM可通过激活AMPK/mTOR信号通路抑制PAH肺动脉平滑肌细胞线粒体自噬,改善PASMC在缺氧条件下的增殖/凋亡失衡,这说明PAH肺动脉平滑肌细胞过度增殖至少部分是由于TUFM被激活促进线粒体自噬而导致的,这为改善PAH肺动脉重塑提供了新的靶点。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

崔本科:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;王岩:提出研究思路,分析实验数据,论文审核;卢云凤:实施研究过程,资料搜集整理;杜鹃:进行统计学分析;翟羽涵:论文修改