乳腺癌组织lncRNA CASC2、miR-532-3p表达水平与患者术后5年内生存的相关性

卜德永,赵连,周应强,刘亮,王帅

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常见肿瘤,其特点是在分子和临床水平上的异质性[1]。近年来,BC的治疗已取得许多进展,但其仍是女性癌症死亡的重要原因[2]。长链非编码RNA癌易感性候选基因2(long non-coding RNA cancer susceptibility candidate 2,lncRNA CASC2)是一种肿瘤抑制基因,能参与调节血管生成及癌细胞增殖和侵袭,其在BC等多种癌症中下调,与癌细胞增殖和诱导细胞凋亡具有密切关联[3-4]。微小RNA(microRNA,miRNA)能参与癌症在内的多种人类疾病。其中,BC组织中miR-532-3p呈高表达,具有致癌作用[5]。报道显示,lncRNA-miRNA轴在上皮间充质转化和癌症干细胞中发挥关键作用,参与癌症进展[6]。研究表明,lncRNA CASC2能通过靶向调节miR-532-3p抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡[7]。但目前lncRNA CASC2、miR-532-3p与BC患者预后的关系尚未见研究报道。因此,现分析lncRNA CASC2、miR-532-3p在BC组织中的表达及其与患者预后的相关性,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月—2018年6月大同市第五人民医院普通外科收治女性BC患者127例,年龄34～67(52.15±6.22)岁,其中≥52岁63例,<52岁64例;绝经69例,未绝经58例;肿瘤直径:≥2 cm 62例,<2 cm 65例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期84例,Ⅲ期43例;肿瘤分化程度:中、高分化88例,低分化39例;有淋巴结转移59例,无淋巴结转移68例;分子分型:Luminal A型37例,Luminal B型35例,HER2过表达型25例,基底样型30例。手术过程中收集患者BC组织及癌旁正常组织。本研究已经获得医院伦理委员会批准(临床2014-10-2),患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①符合《乳腺癌诊疗规范(2018年版)》[8]中的诊断标准,且经病理学确诊;②临床资料完整,且接受随访者;③均是初次确诊患者,入组前未进行相关治疗。(2)排除标准:①存在其他部位恶性肿瘤;②自身免疫性疾病或全身感染性疾病;③脏器功能严重损伤。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 BC组织和癌旁正常组织中lncRNA CASC2、miR-532-3p表达检测:将BC组织及癌旁正常组织制成匀浆,采用RNA抽提试剂盒(广州瑞博公司,批号RB7915)提取BC组织及癌旁正常组织总RNA,反转录合成cDNA(试剂盒购自太原市川至生物公司,批号16724L)。采用PCR扩增仪(美国赛默飞世尔公司,型号SimpliAmp)进行扩增。总反应体系30 μl根据PCR试剂盒(广州瑞博公司,批号RB8139)配制。PCR反应条件:86℃ 4 min、95℃ 17 s、72℃ 15 s、81℃ 22 s,共35个循环。2-△△Ct法计算lncRNA CASC2(内参为GAPDH)、miR-532-3p(内参为U6)相对表达量。所有引物均由深圳子科生物公司合成,引物序列见表1。

表1 lncRNA CASC2、miR-532-3p引物序列

1.3.2 随访:BC患者术后随访5年(以电话和门诊复查为随访方式),随访开始时间为术后第1日,截止时间为2023年6月30日或患者死亡。随访频率:前2年每3个月进行1次随访,后3年每6个月进行1次随访。记录患者5年内生存和死亡情况。

2 结 果

2.1 癌旁正常组织和BC组织lncRNA CASC2、miR-532-3p表达比较 BC组织中lncRNA CASC2表达水平低于癌旁正常组织,miR-532-3p表达水平高于癌旁正常组织(P<0.01),见表2。

表2 癌旁正常组织和BC组织lncRNA CASC2、miR-532-3p表达比较

2.2 BC组织中lncRNA CASC2和miR-532-3p表达在不同临床病理特征中的差异比较 分别以BC组织中lncRNA CASC2、miR-532-3p表达水平的平均值(0.59、3.17)作为临界值,将患者分为lncRNA CASC2高表达组(≥0.59)65例和低表达组(<0.59)62例、miR-532-3p高表达组(≥3.17)61例和低表达组(<3.17)66例。结果发现,BC组织中lncRNA CASC2、miR-532-3p表达水平与年龄、是否绝经、分子分型无关(P>0.05);肿瘤直径≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、肿瘤分化程度低分化、淋巴结转移者比例lncRNA CASC2低表达组高于高表达组,而miR-532-3p低表达组低于高表达组(P均<0.01),见表3。

表3 BC组织中lncRNA CASC2和miR-532-3p表达水平在不同临床病理特征患者中差异比较 [例(%)]

2.3 生存组和死亡组患者临床病理特征及BC组织lncRNA CASC2、miR-532-3p表达差异比较 127例BC患者术后随访5年,生存99例(生存组),死亡28例(死亡组)。2组BC患者年龄、是否绝经、分子分型比较差异均无统计学意义(P>0.05),肿瘤直径≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、肿瘤分化程度低分化、淋巴结转移者比例及miR-532-3p表达水平死亡组高于生存组,而lncRNA CASC2表达水平死亡组低于生存组(P<0.01),见表4。

表4 生存组和死亡组临床病理特征及BC组织中lncRNA CASC2、miR-532-3p表达比较

2.4 BC组织lncRNA CASC2、miR-532-3p表达的相关性分析 由TargetScanHuman网站预测结果可知,lncRNA CASC2与miR-532-3p之间有12个互补结合位点,lncRNA CASC2可能靶向作用于miR-532-3p表达,见图1。BC组织中lncRNA CASC2与miR-532-3p表达呈负相关(r=-0.561,P<0.001)。

图1 lncRNA CASC2靶向miR-532-3p的生物信息学分析

2.5 BC组织中lncRNA CASC2、miR-532-3p表达与患者术后5年内生存的关系 lncRNA CASC2高表达组BC患者术后5年内总生存率为89.23%(58/65),显著高于lncRNA CASC2低表达组66.13%(41/62)(χ2=9.854,P=0.002);miR-532-3p高表达组BC患者术后5年内总生存率为65.57%(40/61),显著低于miR-532-3p低表达组的89.39%(59/66)(χ2=10.466,P=0.001)。

2.6 影响BC患者术后5年内生存的多因素Cox回归分析 以BC患者术后5年内生存为因变量(赋值:是为“0”;否为“1”),以上述结果中P<0.05项目为自变量进行多因素Cox回归分析,结果显示:肿瘤直径≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、肿瘤低分化、有淋巴结转移、lncRNA CASC2低表达、miR-532-3p高表达均是影响BC患者术后5年内生存的独立危险因素(P<0.05),见表5。

表5 影响BC患者术后5年内生存的多因素Cox回归分析

2.7 lncRNA CASC2、miR-532-3p预测BC患者术后5年内的生存价值 绘制lncRNA CASC2、miR-532-3p预测BC患者术后5年内的生存价值ROC曲线,并计算AUC,结果显示:lncRNA CASC2、miR-532-3p及二者联合预测BC患者术后5年内生存的AUC分别为0.840、0.852、0.908,二者联合预测的AUC大于各自单独预测(Z/P=2.246/0.025、2.033/0.042),见表6、图2。

图2 lncRNA CASC2、miR-532-3p预测BC患者术后5年内生存的ROC曲线Fig.2 ROC curves of lncRNA CASC2 and miR-532-3p predicting survival within 5 years after surgery in patients with BC

表6 lncRNA CASC2、miR-532-3p预测BC患者术后5年内生存的价值分析

3 讨 论

BC是一种高度异质性肿瘤,其病因和病理表现因人而异。近年来,BC发病率逐年上升,但由于诊断、治疗及护理的改善,病死率有所下降[9]。BC由复杂的细胞类型组成,包括肿瘤、基质和免疫细胞,每种细胞都可以呈现不同的表型,通过相互作用促进肿瘤进展和治疗耐药性,也强烈影响患者病情进展及预后[10]。因此,寻找预测BC进展及预后的指标至关重要。

许多miRNA和lncRNA能参与乳腺恶性肿瘤的发生和发育过程,可能在BC的早期诊断、治疗和预后方面提供新的见解[11-12]。lncRNA是一种新型基因调节因子,不编码蛋白质,但以RNA的形式调节不同水平的基因表达,与人类疾病尤其是癌症的进展和预后有关。部分lncRNA的异常表达可能与癌细胞过度生长和BC预后不良有关[13-14]。已有研究表明,lncRNA CASC2在BC组织和细胞中表达显著降低,其过表达能抑制BC细胞活力和迁移[15]。Zhang等[16]报道,lncRNA CASC2在BC组织和细胞系中显著下调,其能诱导细胞周期停滞,通过调节转化生长因子-β信号通路抑制BC细胞增殖和转移,诱导BC的早期凋亡。lncRNA CASC2还能调控细胞肿瘤抗原p53基因表达,进而阻断包括乳腺组织在内的多种组织中的癌变过程[17]。在本研究中,BC组织中lncRNA CASC2表达水平显著低于癌旁正常组织;且lncRNA CASC2高表达组BC患者术后5年内总生存率较lncRNA CASC2低表达组高;与Orak等和Zhang等研究结果一致[15-16]。表明lncRNA CASC2可能与BC的发生及预后有关,其高表达提示患者预后生存较好。可能原因是lncRNA CASC2活性低会导致BC细胞增殖和迁移能力增强,导致BC的进展恶化。

miRNA通过抑制信使RNA翻译负调节下游基因表达,在生物过程中起着重要作用[18-21]。有研究表明,miR-532-3p在BC中表达显著上调,是环状RNA(circRNA)103809的直接靶标,其水平上调能逆转circRNA 103809诱导的抗肿瘤效果,进而在BC进展中发挥作用[22]。Peng等[23]报道,三阴性BC组织中miR-532-5p水平升高,miR-532-5p可预测三阴性BC的恶性肿瘤发生和预后不良。本研究发现,BC组织中miR-532-3p表达显著高于癌旁正常组织,且miR-532-3p高表达组BC患者术后5年内总生存率较miR-532-3p低表达组低;与Liu等和Peng等报道的结果一致[22-23]。提示miR-532-3p可能参与BC的发生和预后,其高表达提示患者预后生存较差。可能原因是miR-532-3p高表达会促进BC细胞恶性生物学行为,进而使BC恶性生长。

本研究发现,BC组织中lncRNA CASC2与miR-532-3p表达呈负相关,二者表达与肿瘤直径、TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移相关,表明lncRNA CASC2和miR-532-3p可能存在靶向调控关系,影响BC患者临床病理特征。进一步研究发现,死亡组BC组织中lncRNA CASC2表达水平较生存组低,miR-532-3p表达水平较生存组高,表明lncRNA CASC2和miR-532-3p表达与BC患者术后5年内生存关系密切,可影响BC患者预后。Cox回归分析和ROC曲线发现,肿瘤直径≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、肿瘤低分化、有淋巴结转移、lncRNA CASC2低表达、miR-532-3p高表达均是影响BC患者术后5年内生存的独立危险因素;lncRNA CASC2和miR-532-3p二者联合对BC患者术后5年内生存具有较高预测效能。提示临床上要重点关注BC患者的上述危险因素,对于lncRNA CASC2和miR-532-3p表达异常的BC患者,临床上给予及时的治疗和干预,可延长患者生存期。

综上所述,BC组织中lncRNA CASC2表达下调,miR-532-3p表达上调,且术后5年内死亡的BC患者较存活患者变化更显著,对预测BC患者术后5年内生存情况价值较高。但本研究未探究lncRNA CASC2靶向调控miR-532-3p的具体机制,下一步将通过基础细胞实验来加以验证。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

卜德永:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;赵连:提出研究思路,分析试验数据;周应强:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;刘亮、王帅:进行统计学分析,论文审核